In vitroでのクローニング

TaKaRa LA PCR™ in vitro Cloning Kit

メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR RR015 RR015 TaKaRa LA PCR™ in vitro Cloning Kit
  • バルクなど特別対応可能
10回 ¥39,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 3874 3874 Cassette, Xba I
  • バルクなど特別対応可能
16.5 pmol(500 ng) ¥13,500
別売コンポーネント
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 3877 3877 Cassette, Primer C1
  • バルクなど特別対応可能
1,000 pmol ¥13,500
別売コンポーネント
在庫無くなり次第終売(カスタム対応可能)
説明書・データシート・ベクター情報

一部の製品について

カスタム合成注文にて承ります。
価格など詳細に関しましては、弊社受託窓口までお問い合わせください。

TEL:077-565-6999

製品説明

本製品は、CassetteおよびCassette Primerを使用することによって、cDNAやゲノム上の未知領域をPCR法により特異的に増幅させる従来のPCR in vitro Cloning Kitに、長鎖DNAを正確に増幅するLA PCRテクノロジーを応用したシステムである。これにより、従来効率よく増幅できなかった長鎖の未知領域を簡便にクローニングすることが可能になった。また、LA PCRテクノロジーでは、従来よりも高いfidelityを提供するため、クローニングの場合に懸念されるミューテーションの導入も減少する。
本キットにより、従来のように煩雑なファージ等のライブラリーの調製、スクリーニングを行うことなく目的とするゲノム等の長鎖DNAを得ることができる。

内容

(10回分)(製品コード RR015)
Sau3A I Cassette (200 ng/μl) 25 μl
EcoR I Cassette (20 ng/μl) 25 μl
Hind III Cassette (20 ng/μl) 25 μl
Pst I Cassette (20 ng/μl) 25 μl
Sal ICassette (20 ng/μl) 25 μl
Xba I Cassette (20 ng/μl) 25 μl
Cassette Primer C1 (10 pmol/μl) 20 μl
Cassette Primer C2 (10 pmol/μl) 20 μl
Ligation Solution I * 150 μl
Ligation Solution II * 75 μl
TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 10 μl
10×LA PCR Buffer II (Mg2+ plus) 100 μl
dNTP Mixture (各2.5 mM) 160 μl
Control DNA Fragment (100 ng/μl) 25 μl
Control Specific Primer CS-1 (10 pmol/μl) 10 μl
Control Specific Primer CS-2 (10 pmol/μl) 10 μl

* Ligation Solution I, II は、DNA Ligation Kit Ver.2.1(製品コード 6022)に含まれる試薬と同じものである。

保存

-20℃

Cassette、Cassette Primer(製品コード 3874、3877)

TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kitに含まれるCassette、Cassette Primerの別売りコンポーネントである(凍結乾燥品)。
Cassette Sau3A I
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGA 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TAG OH 5’
Cassette EcoR I 5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG AG 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TCTTA A OH 5’
Cassette Hind III
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG A 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TTCGA OH 5’
Cassette Pst I
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG ACTGC A 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TG OH 5’
Cassette Sal I
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG AG 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TCAGC T OH 5’
Cassette Xba I
3874
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG AT 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TAGAT C OH 5’
Cassette Primer C1 
3877
d(GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA)
Cassette Primer C2 
d(CGTTA GAACG CGTAA TACGA CTCAC TATAG GGAGA)

★カスタム合成注文にて承ります(包装量、純度、価格は異なるのでご注意ください)。

PCRを用いたDNAクローニングの原理

1)クローニングのターゲットとなるDNAを適当な制限酵素で完全消化する。
2)ライゲーション反応により、対応する制限酵素サイトを持つカセットをつなぐ。
3)Cassette Primer C1と、DNA上の既知領域に相補的なプライマーPrimer S1を用いて1回目のPCRを行う。
4) 3)の反応液の一部を用いて、内側のプライマー、Cassette Primer C2およびPrimer S2で2回目のPCRを行い、目的のDNAのみを増幅させる。


図1 PCRを用いたDNAクローニングの原理

カセットの5'末端にはリン酸基が付いていないので、ターゲットDNAの3'末端とカセットの5'末端との接続部位にはニックができる。そのため、1回目のPCRでは、Cassette Primer C1からの合成はこの接続部分でストップし、非特異的な増幅は起こらない。Cassette Primer S1から合成されたDNAだけがCassette Primer C1からの合成の鋳型となり、相補鎖の形成が行われる。さらに、2回目のPCRを内側のプライマー(Primer C2、Primer S2)で行うことにより、効率よく特異的な増幅を行うことができる。タンパク質のアミノ酸配列が部分的にわかっている場合には、その情報を基にして作製したmixed primerを使用することによりそのタンパク質をコードしているcDNAをクローニングすることもできる。

注意

本製品の各Cassetteには T7 プロモーター配列が含まれていますので、1st. PCRおよび 2nd. PCRにより得られたPCR産物にはT7 プロモーター配列が含まれています。
したがって、得られたPCR産物はT7 promoter primerを用いてダイレクトシーケンスすることが可能です。また、T7プロモーター配列を含むクローニングベクター(pT7 Blue T-Vectorなど)にPCR産物をクローニングした場合は、T7 promoter primerを用いてシーケンスすることはできませんので、ご注意ください。

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