Tet誘導性miRNA発現システム (Mir-X™ System)

  • Tet-On AdvancedによるmiRNA誘導システム
  • miRNAの発現を蛍光タンパク質でモニタリング
  • 高い誘導発現量と低い基底発現レベル
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 631118 Z1118N Mir-X™ Inducible miRNA System (Red)
  • ライセンス
1 Set ¥191,600
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 631120 Z1120N Mir-X™ Inducible miRNA System (Green)
  • ライセンス
1 Set ¥191,600
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 631119 Z1119N pmRi-mCherry Vector
  • ライセンス
20 μg ¥89,600
MTAの確認が必要な製品です 説明書・データシート・ベクター情報
CLN 631121 Z1121N pmRi-ZsGreen1 Vector
  • ライセンス
20 μg ¥70,400
MTAの確認が必要な製品です 説明書・データシート・ベクター情報
Mir-X Inducible miRNA System(GreenまたはRed)は、目的のmiRNA配列と蛍光タンパク質レポーター(mCherryまたはZsGreen1)を同時に1本のmRNAとして発現する。また、調節性に優れたTet-On Advanced Expression Systemを採用することで、厳密な転写調節を行える。

原理
目的のmiRNA配列は、miRNA Inducibleベクター(pmRi-mCherry VectorまたはpmRi-ZsGreen1 Vector)上にコードされた蛍光タンパク質遺伝子の下流の3’UTR領域にクローニングされる。Tet-On Advanced調節因子を発現する細胞に、miRNA Inducibleベクターをトランスフェクションすると、培地中に添加したDox(ドキシサイクリン;図1、2)の濃度に応じて目的のmiRNAと蛍光タンパク質が発現する。Doxの培地への添加による転写の誘導は素早く、濃度依存的に調節が行える。
miR-1とmiR-9のターゲット配列を分泌性のルシフェラーゼ遺伝子に融合し(RNAi Monitor)、MCF7 Tet-On Advanced Cell中で構成的に発現させ、miRNAの発現誘導をモニターした(図3)。DoxによるmiR-1またはmiR-9の誘導で、ルシフェラーゼ活性(補正後)が、コントロール細胞に比較して90%以上抑制されていた。

赤色または緑色蛍光による検出
Mir-X Inducible miRNAシステムは、DoxによるmiRNA発現調節ベクターのほか、薬剤選択マーカーDNA、専用の血清(FBS)、コントロールベクターと必要になるすべてを含んでいる。また、システムを構成する誘導性のベクターpmRi-mCherry vectorまたはpmRi-ZsGreen1 vectorは単品でも販売しており、クロンテックのTet-On/Off発現調節システムと併せて使用できる。
図1. Mir-X Inducible SystemによるマイクロRNAの発現誘導
Tet調節性トランスアクチベーター(Tet-On Advancedタンパク質)は、改変型の大腸菌TetリプレッサーrTetRとHSV-VP16(転写活性化因子)の最小領域を3回反復させて融合している。Doxの存在下でTet-On Advancedタンパク質は誘導性のPTightプロモーターに結合し、蛍光タンパク質遺伝子(mCherryまたはZsGreen1)と、その3’UTRに目的のmiRNA配列をコードする1本のmRNAの転写を活性化する。

図2. pmRiによる転写ユニットを発現し強い蛍光を示す細胞
pmRi-mCherry VectorまたはpmRi-ZsGreen1 VectorからmiR-1を発現するMCF-7 Tet-On Advanced細胞はDox存在下で強い蛍光を示した。

図3. miR-1とmiR-9のターゲット配列を融合させたルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制
RNAi Monitorシステムを用いて、miR-1とmiR-9のターゲット配列を分泌性のルシフェラーゼ遺伝子の3’UTRに融合し構成的に発現するベクターを構築した。これらのベクターを、miR-1またはmiR-9 miRNA配列を持つpmRi-ZsGreen1 vectorと共にMCF7 Tet-On Advanced Cellにコトランスフェクションした。pmRi-ZsGreen1 vector(miRNAインサートなし)を陰性コントロールに使用した。DoxによるmiR-1またはmiR-9 miRNAの誘導でルシフェラーゼ活性(補正後)が90%以上の割合で抑制された。

アプリケーション
ドキシサイクリンによるmiRNAの発現調節システム

内容

Mir-X Inducible miRNA System(Red)、または(Green)
(製品コード 631118、または631120)
・pTet-On Advanced Vector
・Tet System Approved FBS, US-Sourced
・pmRi-mCherry Vector(製品コード 631119)(Red systemのみ)、またはpmRi-ZsGreen1 Vector(製品コード 631121)(Green systemのみ)

pmRi-mCherry Vector、またはpmRi-ZsGreen1 Vector
(製品コード 631119、または631121)
・pmRi-mCherry Vector、またはpmRi-ZsGreen1 Vector
・pTRE-Tight-Luc Vector
・Linear Hygromycin Marker
・Linear Puromycin Marker

保存

-20℃

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