ブレビバチルス菌体内発現ベクター

メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
HIG HB131 HB131 pNI DNA
  • ライセンス
  • バルクなど特別対応可能
10 μg ¥35,000
説明書・データシート・ベクター情報
HIG HB132 HB132 pNI-His DNA
  • ライセンス
  • バルクなど特別対応可能
10 μg ¥35,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

Brevibacillus(ブレビバチルス、Bacillus brevis)発現システムは高効率でのタンパク質生産能に優れたシステムである。本菌はグラム陽性の細菌で、特にタンパク質を大量に分泌生産する特長を有している1)。この特長を生かし、これまでに多数の異種タンパク質分泌生産に成功してきた。
しかし、最近の研究により、分泌生産だけではなく菌体内生産においても本菌は優れた性質を示すことが分った。大腸菌では不溶化して沈殿するタンパク質も、本菌で生産させると可溶性の状態で回収することも可能である。
pNI DNA、pNI-His DNAはブレビバチルス内で強力に働くP2プロモーターを用いた菌体内発現ベクターである。本来細胞内に作られ機能するタンパク質で、大腸菌では生産物が不溶化してしまい、in vitro リフォールディングも困難である場合にも、pNI DNA、pNI-His DNAが有効である。
本システムは以下に示すような特長がある。

  • 可溶性の形で異種タンパク質を効率良く菌体内に生産する
  • 培養、滅菌が容易
  • 遺伝子操作が簡単
  • 安全な宿主
本システムの宿主は形質転換効率が高いため、遺伝子操作を簡単に行うことができる。大腸菌とのシャトルベクターを用いて、発現ベクターを大腸菌内で構築する。また、N末にHisタグが付加されるタイプのベクター(pNI-His DNA)を用いると、Hisタグ融合タンパク質精製カラムで簡単に目的タンパク質を精製でき、精製後付加されたHisタグをEnterokinaseで処理することにより除去することも可能である。

内容

  • pNI DNA(製品コード HB131) 10 μg(0.2 μg/μl)
    pNI-His DNA(製品コード HB132) 10 μg(0.2 μg/μl)

保存

-20℃

DNAシーケンスデータ

ZIP形式で圧縮しておりますが、StuffIt Expander等でも解凍できます。
pNI(テキストデータ)
pNI-His(テキストデータ)

Brevibacillus発現システム菌体内発現ベクターの概略

  1. 発現ベクターの選択
    1. pNI DNA
      pNI DNAは、分泌発現用ベクターであるpNCMO2 DNA(製品コード HB112)から分泌シグナル部分を除去して菌体内に生産物が蓄積するように作られた菌体内発現用ベクターである。それ以外の基本的な構造はpNCMO2 DNAと共通である。Brevibacillusと大腸菌のシャトルベクターで、大腸菌内で発現プラスミドを構築後、Brevibacillusに導入、発現試験に進むことが出来る。
      pNI DNAの発現プロモーターには宿主菌の細胞壁タンパク質由来のP2プロモーターを用いている。P2プロモーターは大腸菌内では働きが弱いため、目的遺伝子のクローニングに有利である。一方、Brevibacillusにおいては非常に強いプロモーターとして働く。従って、Brevibacillusでの効率的なタンパク質生産に適している。

    2. pNI-His DNA
      pNI-His DNAはコバルトあるいはニッケルキレート樹脂により生産物を簡単に精製出来るように、N末にHisタグ配列(6×His配列)およびタグ除去のためのEnterokinase認識配列が付加されるように作られた菌体内発現用ベクターである。それ以外はpNI DNAと共通である。
    pNI DNA:5,055 bp
    pNI-His DNA:5,079 bp
    図1. pNI DNAのベクターマップ

  2. 発現ベクターへのクローニング
    pNI DNAの場合はNco I に始まるマルチクローニングサイトに目的タンパク質の遺伝子を挿入する。Nco Iサイトが使える場合には、マルチクローニングサイトに由来する余分なアミノ酸が目的タンパク質に付加されることはないが、Nco Iサイト以外の場合には使うサイトに応じて余分なアミノ酸がN末に付加される。
    pNI-His DNAの場合には目的タンパク質の遺伝子はBamH I以後のサイトに挿入する。

  3. Brevibacillusの形質転換
    Brevibacillusの形質転換はNTP法(New Tris-PEG法)によって行う。選択はネオマイシン耐性によって行う。シャトルベクターを用いて大腸菌でサブクローニングする場合は、アンピシリン耐性によって選択する。

  4. タンパク質生産の確認とスケールアップ
    ネガティブコントロールを同時に培養し、目的タンパク質の発現を確認する。目的タンパク質発現プラスミドを導入した形質転換体をピックアップし、指定の液体培地で振とう培養することにより、48~64時間で目的のタンパク質が得られる。培養菌体をSDS-PAGE等で解析することにより、発現の有無が確認できる。高い生産量が必要とされる場合には、スケールアップを行う。Brevibacillusのラージスケールでの培養は比較的容易である。

使用上の注意

本製品と共に使用する、Brevibacillus choshinensis HPD31-SP3には、Saccharomyces cerevisiae由来2μmプラスミドDNAの部分配列が含まれます(製品コード HB200、HB116)。これらは、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」で規定する遺伝子組換え生物等に該当します。ご使用の際は、「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置を定める省令」(平成16年文科省・環境省令第1号)および貴組織内の安全委員会の指示に従ってください。

ブレビバチルス発現システム関連製品は、ヒゲタ醤油株式会社が開発・製造し、タカラバイオ株式会社が販売しています。本製品は研究目的にのみ使用が許可されています。
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タカラバイオ(株)  営業部 営業企画担当
TEL:077-565-6972  FAX:077-565-6987
ライセンス同意書

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