C末端ペプチドの選択的単離に

Anhydrotrypsin Agarose

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略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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参考
資料
TKR 7302 7302 Anhydrotrypsin Agarose
1 ml gel ¥116,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

本製品は、bovine pancreatic trypsinの活性中心Ser残基をdehydro-alanine残基に化学変換したanhydrotrypsin(触媒活性は喪失)を臭化シアン法でアガロースゲルに固定化したアフィニティークロマトグラフィー用特異的吸着体である。本製品によるアフィニティークロマトグラフィーで、タンパク質のプロテアーゼ消化物中から適当な長さのC末端ペプチドフラグメントを容易に単離することができ、C末端一次構造の解析に有用である。

C末端がArgまたはLysでないタンパク質(還元S-アミノエチル化ペプチドも含む)の場合、trypsin消化後Anhydrotrypsin Agaroseで分画すると、C末端にArg、LysまたはAECys(S-アミノエチルシステイン)を有するペプチドフラグメントはゲルに吸着されるが、元のタンパク質(ペプチド)のC末端ペプチドフラグメントは非吸着画分に回収される。一方、C末端がArgまたはLysであるタンパク質の場合、chymotrypsin消化物をAnhydrotrypsin Agaroseにかければ、吸着画分にC末端ペプチドが得られる。得られたC末端ペプチドフラグメントは、必要に応じて逆相系HPLCで精製後、Edman分解法などによって構造決定することができる。(図1)

Anhydrotrypsin Agaroseの活用法

保存

0.02%アジ化ナトリウムを含む開始Bufferで平衡化させ、4℃保存。
ゲルを長時間pH2.5(0.1 Mギ酸)に放置しておくことは避ける。

特長

  • C末端にArg、LysまたはAECys(S-アミノエチルシステイン)を有するペプチドを、弱酸性下で選択的に結合する(ただし、遊離アミノ酸、ジペプチドは結合しない)。
  • 結合親和力は、native trypsin固定化体の親和力よりはるかに強い。
  • C末端がArg、Lysでないタンパク質は、trypsin消化物を本製品にかけることでC末端ペプチドを非吸着画分に回収できる。
  • C末端がArg、Lysであるタンパク質は、chymotrypsin消化物を本製品にかけることでC末端ペプチドのみを吸着・溶出できる。
  • 結合した複数のペプチドを別々に溶出させることができる。(注意〔1〕参照)
  • 吸着体を容易に再生できる。
  • 残存trypsin活性はほとんど検出されない。

結合容量

  • Bz-Gly-Arg 約60 nmol/ml wet gel
    測定方法:Bz-Gly-Argを0.05 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)の条件下で結合させた後、0.1 Mギ酸で溶出
  • Kunitz soybean trypsin inhibitor(STI)約80 nmol/ml wet gel
    測定方法:STIを0.02 M CaCl2を含む0.05M Tris-HCl緩衝液(pH8.2)の条件下で結合させた後、0.1 Mギ酸で溶出

形状

0.02 M CaCl2および0.02%アジ化ナトリウムを含む0.05 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に懸濁

使用方法

  1. サンプルの調製
    • タンパク質をtrypsinで消化する。1 mM DFP(diisopropylfluoro-phosphate)を加えて反応を停止し、酢酸を加えてpH5.0に調整し、サンプル溶液とする。この際0.02 M塩化カルシウムを特に加える必要はない。
    • サンプル液量はカラム体積程度以下に止めておく。
    • サンプルに含まれるペプチド量(タンパク質消化物中のペプチド全量)の上限は、Bz-Gly-Argに対する結合容量を参考にする。
    • 2~4 M尿素の混在するサンプルでも、pH5.0に調整後、直接Anhydrotrypsin Agaroseカラムにかけることができる(注意〔2〕参照)。
  2. 操作方法
    以下の操作はすべて4℃で行う。
    (1)ゲルをカラムに充填し、ベッド体積の20倍量(20カラム体積)以上の開始Buffer(0.02 M塩化カルシウムを含む0.05 M酢酸ナトリウム緩衝液, pH5.0)で平衡化する。
    (2)サンプル溶液をゲルに添加する。
    (3)ゲルを約20カラム体積の開始Bufferで流速17 ml/hr/cm2程度で洗浄する。この操作によりC末端にArg、LysまたはAECysを有しないペプチドはカラムに結合せず溶出される(trypsinはArg-Pro、Lys-Pro結合を切断しないが、このような部分を含むペプチドもカラムに結合しない)。
    (4)ゲルに結合したペプチドの溶出液として、5 mM塩酸(pH約2.5)または0.1 Mギ酸(pH約2.5)を用いる。通常10カラム体積程度流す(注意〔1〕参照)。

再生

  • ゲルは5 mM塩酸または0.1 Mギ酸(いずれもpH2.5)で洗浄後、開始Bufferで平衡化することにより再生できる。
  • ゲルの結合容量に低下が認められた時は、ゲルを20カラム体積の3 M~6 M尿素を含む開始Buffer 注)により4℃で1時間かけて洗浄する。
注)6 M尿素でゲルを5回洗浄して再生した場合でもSTIに対する結合容量は変化しないが、Bz-Gly-Argに対する結合容量に若干の低下(1回の洗浄で約4%)が認められるので、尿素による洗浄はまず3 M濃度で実施する。

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