リン酸化ペプチド濃縮用スピンカラム

  • あらゆるタイプのリン酸化ペプチドの効率的で特異的な濃縮
  • 便利なプレパック式スピンカラム
  • 高感度質量分析(マススペクトロスコピー)を実現
  • 結合容量:250 μg phosphopeptide/column
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 635634 Z5634N Phosphopeptide Enrichment Spin Columns
25本 ¥56,700
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 635635 Z5635N Phosphopeptide Enrichment Buffer Kit
  • 労働安全衛生法
  • 安全データシート(SDS)添付
1 Set ¥25,200
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

タンパク質のリン酸化はタンパク質制御にとって重要な意味を持ち、酵素活性やタンパク質間相互作用をはじめ、細胞内の代謝速度に至るまで全てに影響している。リン酸化は極めて可逆性に富み、通常タンパク質の配列中にはリン酸化可能な部位が複数存在していることから、実際のリン酸化部位の決定は経験に頼らなければならないことが多いのが現状である。質量分析法は、タンパク質の翻訳後、修飾の検証に多くの実績を持つ確立された方法である(1~3)が、リン酸化タンパク質の検出についてはその量が微量であることから多くの困難が伴った。しかし、Phosphopeptide Enrichment Spin ColumnsとPhosphopeptide Enrichment Buffer Kitを用いる濃縮法を利用すれば、従来検出は不可能であったリン酸化ペプチドも検出できるようになる。

クロマトグラフィーの原理

Clontechはリン酸基が鉄イオンに結合するという原理を応用して、リン酸化ペプチドを結合するユニークな固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを開発した。さらにバッファーをリン酸化ペプチドの特異的結合と溶出に合わせて最適化し、簡便な精製方法を開発した。こうして完成した製品は、ペプチドのリン酸化研究に理想的なツールである。このディスポーザブル・スピンカラムは、最大250 μgのリン酸化ペプチドを結合することができる。様々なサンプル濃度およびサンプル量(最大850 μl)に対応できる。ディスポーザブル・スピンカラムのサイズは大部分のマイクロ遠心器にフィットするのでとても便利である。カラムを前もって平衡化する必要はない(保存バッファーから取り出して遠心するだけです)。別売のバッファーキット(製品コード 635635)には、便利で一般的な使用目的に合ったローディングバッファーと溶出バッファーが含まれている。これらのバッファーは界面活性剤を含んでいない。その後の使用目的に合わせたバッファーで、濃縮リン酸化ペプチドを溶出することもできる。濃縮画分はそのまま質量分析法やHPLCで分析できる。元の濃度や検出方法の感度によっては、サンプルをさらに濃縮する必要がある。

最適化された結合と溶出

リン酸化ペプチド濃縮用スピンカラムを使って適切な結果が得られることを示すために、βカゼインタンパク質消化サンプルからの濃縮を行い、逆相HPLCを使って分析した。
βカゼインはトリプシン消化により16種類のペプチドが得られ(図1、パネルA)、そのうちの2種類がリン酸化されていることが知られている(1)。サンプルをスピンカラムにかけ濃縮操作を行ったところ、溶出画分にはこの2種類のリン酸化ペプチドが検出されたことから、スピンカラムがリン酸化ペプチドのみを特異的に結合することが実証された(図1、パネルB)。リン酸化ペプチドのこの結合特異性は、さらにβカゼインを脱リン酸化することでも実証された。すなわち、ホスファターゼ処理を加えるといずれのペプチドもカラムに結合しなかった(図1、パネルC)。


図1. Phosphopeptide Enrichment Spin Columnsを用いて精製したβカゼインのリン酸化ペプチド
βカゼインタンパク質をトリプシン(配列分析用)で消化した。消化したタンパク質をローディングバッファーで1:1の割合に希釈してからPhosphopeptide Enrichment Spin Columnsにかけた。濃縮画分を溶出バッファーを使って溶出し、凍結乾燥してから0.1% TFA水溶液(v/v)で溶解した。粗タンパク質消化物(パネルA)、溶出液(精製リン酸化ペプチド:パネルB)および脱リン酸化サンプルの溶出液(パネルC)の逆相HPLC(RP-HPLC)データを示している。溶出画分はXTerraBP18カラム(5 μm、4.6×150 mm)を用い、RP-HPLCで分離し(溶媒A;0.1% TFA水溶液[v/v]、溶媒B:0.1% TFAアセトニトリル溶液[v/v])、215 nmのUV検出した。パネルBで採取された2種類のリン酸化ペプチド画分はMALDIで分析した。

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