Cellartis Hepatocyte Differentiation Kitは胚体内胚葉細胞から高均質な肝細胞（90％以上）へ分化誘導できるキットである。得られた肝細胞は毒物代謝研究や毒性スクリーニングに適した代謝酵素の発現を有している。本製品により、25種のヒト多能性幹細胞株由来の胚体内胚葉細胞から肝細胞へ分化誘導できた（参考文献1）。さらに、胚体内胚葉細胞としてCellartis Definitive Endoderm cells（製品コード Y10040）を使用して肝細胞を得ることもできる。
ヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導を行う場合は、Cellartis iPS cell to Hepatocyte Differentiation system（製品コード Y30055）の使用をお勧めする。


ヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導のフロー

本製品1キットにて胚体内胚葉細胞から50 cm²面積に相当する肝細胞を分化誘導できる。

・	Hepatocyte Thawing and Seeing Medium（1）	25 ml
・	Hepatocyte Progenitor Medium（2）	50 ml
・	Hepatocyte Maturation Medium Base （3A）	24 ml×2本
・	Hepatocyte Maturation Medium Supplement （3B）	2.6 ml
・	Hepatocyte Maintenance Medium（4）	50ml×3本＊
・	Hepatocyte Coating	7.5 ml

* 11日間培養を維持できる容量です。それ以上の日数の培養には、別売りのCellartis Hepatocyte Maintenance Medium（製品コード Y30051）をご利用ください。

・ヒト胚体内胚葉細胞 ・Fetal bovine serum (FBS) or KnockOut Serum Replacement (KOSR)^＊
・PBS Dulbecco’s w/o Ca^2＋ & Mg^2＋ (D-PBS -/-)^＊
・TrypLE Select Enzyme^＊
・Cell culture vessels, tissue culture treated polystyrene surface
・General cell culture equipment used in cell culture laboratory

* Cellartis Definitive Endoderm Differentiation Kitを利用される場合に必要である。

－20℃

図1. 肝細胞への分化誘導過程における免疫組織染色結果
Cellartis　Definitive Endoderm ChiPSC18とCellartis　Hepatocyte Diff Kitを使用して分化誘導した肝細胞を肝マーカー抗体にて免疫 染色した結果、培養14日目、21日目においてHNF4α（緑）、CK18（赤）の高い発現が確認できた。 28日目からCYP3A（赤）、アルブミン（緑）の発現がみられ、37日目ではmetabolic zonation（代謝機能の領域特異性）がみられた。
図2. 肝細胞への分化誘導過程における遺伝子発現プロファイリング
Cellartis Definitive Endoderm ChiPSC18 cellsとCellartis Hepatocyte Diff Kitを使用して分化誘導した細胞について肝マーカー遺伝子およびCYP遺伝子のmRNA発現量をRT-qPCRで解析した。その結果、11日目から32日目にかけて肝細胞へ分化していることが確認できた。


図3. 肝細胞への分化誘導過程におけるCYP活性の変化
Cellartis Definitive Endoderm ChiPSC18 cellsとCellartis Hepatocyte Diff Kitを使用して分化誘導した細胞についてCYP活性を測定した。その結果、21日目から32日目にかけてCYP1A、CYP3A、CYP2C9の活性が認められた。
CYP1Aはacetaminophen、CYP3Aは1-OH-Midazolam、CYP2C9は4-OH-Diclofenacの生成を測定された。

本製品は、ヒトiPS細胞由来の分化細胞です。添付の文書をご確認のうえ、お取扱いにはご注意ください。 ヒトiPS細胞由来分化細胞の使用について

25種の幹細胞株（ヒトES／iPS細胞）で本製品を利用して肝細胞への分化誘導を確認

1. Annika Asplund et al.
   One Standardized Differentiation Procedure Robustly Generates Homogenous Hepatocyte Cultures Displaying Metabolic Diversity from a Large Panel of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. 2016 Feb;12(1):90-104.

■肝細胞分化状態のモニタリングに最適なツール

多能性幹細胞から肝細胞への分化誘導状態を様々な指標で評価することができる。

[ 肝細胞分化時に発現変動のある88種類の遺伝子を指標 ]
PrimerArray Hepatic Differentiation (Human)

[ 初期段階の指標であるαフェトプロテインを指標 ]
Anti-Human Alpha Fetoprotein, Monoclonal
Human Alpha Fetoprotein (AFP) EIA Kit

[成熟過程の指標であるヒトアルブミンタンパク質を指標 ]
Anti-Human Albumin, Monoclonal (Clone hAlb 3-7A 他)
Human Albumin EIA Kit

[ ミトコンドリアDNAを指標^＊1 ]
Human Mitochondrial DNA (mtDNA) Monitoring Primer Set

*1 iPS細胞等の多能性幹細胞から肝細胞方向への分化・誘導過程でmtDNAコピー数が増加することが報告されている。
・Yue Yu et al. , Hepatocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells: Relevance to cellular therapies. Stem Cell Research, 2012 9(3), 196-207.