ProteoTuner™ Quantitationシステム

  • 標的タンパク質“量”のコントロールと定量を実現
  • 酵素ベースのワンステップ定量アッセイ
  • 面倒なウェスタンブロット解析不要
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 632196 Z2196N ProteoTuner™ Quantitation System
  • 取寄
  • 労働安全衛生法
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
1 Set ¥156,600
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 631073 Z1073N DD Monoclonal Antibody
50 μl ¥34,000
説明書・データシート・ベクター情報

ProteoTuner Quantitation Systemは、標的タンパク質“量”を可逆的に制御できる“ProteoTunerシステム”と、簡便かつ直接的にタンパク質量を定量できる“ProLabelアッセイ”を融合してできた画期的なタンパク質発現・定量システムである。

ProteoTunerシステム;細胞内の標的タンパク質量をコントロール

ProteoTunerシステムは、従来の転写レベルでの制御(遺伝子発現誘導システム)や翻訳レベルでの制御(RNAi)とは全く異なり、直接的に標的タンパク質の量を制御することができるシステムである。ProteoTunerシステムは、Destabilization Domain(DD:不安定化ドメイン, 12 kDa)を標的タンパク質に融合して発現させるためのベクターと、DDの安定化リガンドである膜透過性の低分子化合物Shield1から構成される。細胞中で発現したDD融合タンパク質は、プロテアソームにより迅速に分解を受けるが、Shield1を細胞培養液中に添加すると、Shield1がDDタグに結合し、DD融合タンパク質を安定化させる。添加するShield1量を調節することで、DD融合タンパク質の量を厳密に制御することができ(図1、パネルA)、培地交換により培養液中のShield1を除けば、再びDD融合タンパク質を迅速に分解させることができる。

ProLabelアッセイ;シンプルで高感度なタンパク質定量法

ProLabelアッセイは、機能的に不活性な2つのフラグメントが会合することで完全な活性型酵素を形成する、enzyme fragment complementation assayの原理に基づいている(図1、パネルB)。標的タンパク質に融合したProLabelタグがEnzyme Acceptor(EA)と会合すると活性型酵素が形成され、化学発光基質を開裂しシグナルが得られる。ProLabelアッセイで検出される発光シグナル値は、サンプル中のProLabelタグ融合タンパク質量と直線的に相関する。

タンパク質量制御 & タンパク質定量システム

ProteoTuner Quantitationベクターは、ProteoTunerシステムのDDタグと、ProLabelアッセイのProLabelタグを搭載している。MCSに標的タンパク質をコードする遺伝子をクローニングすると、N末端側にDDタグ、C末端側にProLabelタグを融合して標的タンパク質を発現させることができる。
ProteoTuner Quantitation Systemは非常に簡単に使用できる。停止コドンを除いた標的遺伝子をMCSにクローニングし、コンストラクトを細胞に導入する。実験を開始する際には、Shield1を培地に添加して標的タンパク質の安定化を行う(図1、パネルA)。タンパク質の安定化度合いを確認するには、培養細胞の一部からライセートを作製し、システムに含まれるProLabel Detection Kit IIを用いてタンパク質定量を行うだけである(図1、パネルB)。

ProteoTuner Quantitation Systemは、標的タンパク質量の厳密なコントロールを実現し、より簡便な方法でウェスタンブロット解析などと同等のタンパク質定量を行うことができるシステムである。

図1. ProteoTuner Quantitationシステムの概要
パネルA:ProteoTunerシステム:Shield1(膜透過性低分子リガンド)は、DD融合標的タンパク質のDDタグに結合すると、これをプロテアソームの分解から保護する。Shield1を除去するとDD融合標的タンパク質は迅速に分解される。本システムのデフォルト経路ではShield1が存在しないため、DD融合タンパク質は分解される。なお、ProteoTuner Quantitationシステムでは、DD融合標的タンパク質は6 kDaのProLabelタグ(PL)をC末端側に融合して発現する。
パネルB:ProLabelアッセイ:標的タンパク質に融合したProLabelタグがEnzyme Acceptor(EA)と会合すると、活性型酵素が形成され化学発光基質を開裂する。このシグナルは標準的なルミノメーターで検出できる。



図2. ProLabelアッセイによりShield1安定化タンパク質の正確な定量が可能
本システムの信頼性を確認するため、単量体蛍光タンパク質AcGFP1をProteoTuner Quantitationベクターにクローニングし、培養細胞に導入後、異なる濃度のShield1(0~1,000 nM)で処理した。安定化したDD-AcGFP1-PLタンパク質量は、ProLabelアッセイ(パネルA)とフローサイトメトリー(パネルB)、さらに抗AcGFP1抗体を用いたウェスタンブロット解析(パネルC)により定量した。
3つの方法を比較した結果から、ProLabelアッセイは簡便かつ確実に標的タンパク質を定量できていることが分かる。
Neg=negative control; nontransfected cells.
Pos=ProLabel positive control.
AcGFP1の検出にはLiving Colors A.v. Monoclonal Antibodyを使用

内容

・pPTuner Q Vector
・Shield1
・ProLabel Detection Kit II

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