ProteoTuner™ Guard システム

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略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 631095 Z1095N Retro-X™ ProteoTuner™ Guard System C
  • ライセンス
1 Kit ¥142,100
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 631093 Z1093N Retro-X™ ProteoTuner™ Guard System N
  • ライセンス
1 Kit ¥142,100
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 635051 Z5051N Guard1
60 μl ¥19,600
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 635052 Z5052N Guard1
500 μl ¥59,700
説明書・データシート・ベクター情報

ProteoTuner Systemは、不安定化ドメイン(DD)と融合させた目的タンパク質を、低分子リガンドの添加または除去により、リガンド依存的に安定化もしくは不安定化することで、培養細胞内での目的タンパク質量を制御できるシステムである。リガンドとDDタグはそれぞれ2種類あり、Shield1リガンドにはDDタグが、Guard1にはDDGタグが対応する。

2種類のタンパク質を独立に制御可能

不安定化ドメイン(DD)として、ProteoTuner Shield SystemではFKBP12由来(1)の、Guard SystemではecDHFR由来(2)の修飾DDタグを使用している。それぞれ別々のタンパク質安定化技術であるため、互いに独立して作用する。

システムのタイプ概要
ProteoTuner Shield System目的タンパク質をDDタグと融合し、培地にShield1リガンドを添加することで迅速に安定化させる
ProteoTuner Guard System目的タンパク質をDDGタグと融合し、培地にGuard1リガンドを添加することで迅速に安定化させる

目的タンパク質に応じた最適なシステムの選択

N末標識か?それともC末標識か?-DDタグを目的タンパク質のN末端に融合させた場合(System N)、ほとんどのタンパク質(Clontech社調べ)で効率よく不安定化され、迅速なタンパク量の減少が確認されている。一方、C末端に融合した場合(System C)、リガンド非存在下での不安定化は、若干低下する傾向にある。

ProteoTuner Shield Systemは、目的タンパク質をN末端修飾した場合には、ほとんどのタンパク質において顕著な不安定化を示す。一方、ProteoTuner Guard Systemは、目的タンパク質の発現レベルが低い時に効果的に機能する。

本システムにおいて、プラスミドのトランスフェクションにより発現レベルが高くなる場合には、ProteoTuner Guard Systemによるタンパク質不安定化が不完全になり、バックグラウンドが高くなることが報告されている。この場合、低発現プロモーターベクターを使用することも可能であるが、レトロウイルスを用いて、0.5~5/cellの低いMOIでコピー数を制御する方法が最適である。

一方、膜貫通タンパク質の解析にはProteoTuner Guard Systemが最適である。Guard System不安定化ドメイン(DDG)をC末端に融合したCD8a(膜貫通タンパク質)では、Shield Systemの不安定化ドメイン(FKB12システム)を標識した場合よりも、不安定化を効率よく誘導できたことが報告されている。(Iwamoto et al. (2))


図1. リガンド依存的な目的タンパク質の可逆的な安定化
不安定化ドメイン(DD; 青)を融合した目的タンパク質を発現させる。膜透過性低分子リガンド(赤)を添加すると、リガンドはDDと結合し、タンパク質はプロテアソームにより分解されないようになる。しかし、リガンドを除去すると、融合タンパク質は迅速に分解される。つまり、ProteoTuner Systemでは、リガンド(Shield1もしくはGuard1)存在下でタンパク質が安定化され、リガンド非存在下で不安定化されることになる。なお、本システムには2種類のシステム: ProteoTuner Shield(プラスミドもしくはウイルス導入)とProteoTuner Guard(ウイルス導入)がある。


図2. 二種類のタンパク質を迅速かつ独立にコントロール
ProteoTuner Shield SystemおよびProteoTuner Guard Systemでは、別々の異なった不安定化ドメインとリガンドを使用している。1種のタンパク質にShield不安定化ドメイン(DD)を融合し、別のタンパク質にGuard不安定化ドメイン(DDG)を融合することにより、2種類のタンパク質を同時に個別にタンパク質量をコントロールすることが可能である。
Shield1およびGuard1を同時に添加することにより、両方のタンパク質が安定化される(左図)。Shield1またはGuard1のどちらか一方を添加すれば、1種のタンパク質のみを安定化させることができる(中央図)。Shield1とGuard1のどちらも添加しなければ、両タンパク質を不安定化できる(右図)。


図3. リガンド量に依存したDD-融合AcGFP1蛍光タンパク質の安定化
不安定化ドメイン(DD)を融合したAcGFP1蛍光タンパク質プラスミド(pDD-AcGFP1-PL)を細胞に形質転換した後、各指定量のShield1を培地へ添加した。これらの細胞において、Living Colors A.v. Monoclonal Antibodyを用いたウエスタンブロットによりAcGFP1タンパク量を定量した。



図4. ProteoTuner Guard Systemを用いたタンパク質安定化の制御
AcGFP1をpLVX-PTuner2 Vectorの DDGの下流にクローニングし、パッケージング細胞に形質転換した。ウイルス粒子を回収し、HeLa細胞に感染させた。ウイルス添加後、1時間スピンし、感染6時間後、新しい培地に移し14時間培養した。
パネルAは、感染させたHeLa細胞から培地を除去し、Guard1(500 nM)を含む培地と交換した後、一定時間ごとに細胞を回収しフローサイトメトリーにより分析した結果である。
パネルBは、感染させたHeLa細胞から培地を除去し、様々な濃度のGuard1を含む培地と交換した後、15時間後の細胞を回収し、フローサイトメトリーにより分析した結果である。

内容

Retro-X ProteoTuner Shield System N
(製品コード 631093)
・pRetroX-PTuner2 Vector
・Guard1

Retro-X ProteoTuner Shield System C
(製品コード 631095)
・pRetroX-PTuner2-C Vector
・Guard1

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-20℃

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