Tet 誘導性バイディレクショナル発現ベクター

  • 2つの遺伝子の発現を同時かつ均等に調節可能
  • 同時に発現誘導されるレポーターにより、標的遺伝子の発現レベルを間接的にモニタリング
  • テトラサイクリン制御性トランス活性化因子と組み合わせて、あるいはTet / Tet-Advanced細胞株で使用可能
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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ベクター情報
参考
資料
CLN 631068 Z1068N pTRE-Tight-BI Vector
20 μg ¥111,200
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CLN 631066 Z1066N pTRE-Tight-BI-AcGFP1 Vector
  • ライセンス
20 μg ¥100,900
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CLN 631065 Z1065N pTRE-Tight-BI-DsRed Express Vector
  • ライセンス
20 μg ¥140,100
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CLN 631067 Z1067N pTRE-Tight-BI-ZsGreen1 Vector
  • ライセンス
20 μg ¥100,900
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CLN 631004 Z1004N pBI-G Tet Vector
10 μg ¥91,700
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CLN 631005 Z1005N pBI-L Tet Vector
10 μg ¥91,700
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CLN 631006 Z1006N pBI Tet Vector
10 μg ¥91,700
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CLN 631625 Z1625N Linear Hygromycin Marker
2 μg ¥31,900
CLN 631626 Z1626N Linear Puromycin Marker
2 μg ¥31,900

Bidirectional Tet Expression VectorsをTet-OffあるいはTet-On Cell Lineで使用すると、1ヵ所のテトラサイクリン応答因子(TREあるいはTREmod;1)の調節下で2種類の遺伝子を同時に発現させることができる。発現させる遺伝子には、目的遺伝子とレポーター遺伝子の組み合わせや2種類の目的遺伝子の組み合わせなどが選べる。本ベクターは以下の用途に使用できる。
・直接的または簡便な測定法がない目的遺伝子の発現をレポーター遺伝子の共発現でモニターする。
・レポーター遺伝子の発現をモニターして、誘導能が高くバックグラウンドが低いクローンのスクリーニングと選択を行う。
・ドキシサイクリンに対するレポーター遺伝子の発現に基づき、目的遺伝子の相対的発現レベルの情報を得る。
・2種類の目的遺伝子の発現を同一細胞中で同時に調節する。

pTRE-Tight-BI Vectorは、改良型テトラサイクリン応答因子を搭載している(図1)。
pBI-GおよびpBI-L Tet Vectorは、lacZ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれレポーターとして搭載している。pBIベクターには従来タイプのTREが含まれる。


図1. pTRE-Tight-BI発現ベクターの概略図
pTRE-Tight-BI応答発現ベクターには、同一の配列を持つ2ヵ所の最小CMVプロモーター(PminCMV)が逆方向に存在し、改良型のテトラサイクリン応答因子(TREmod)は両プロモーターの間に存在している。これにより、2つの独立した遺伝子の同時制御(pTRE-Tight-BI)または目的遺伝子と蛍光レポーターの同時発現(pTRE-Tight-BI-ZsGreen1、pTRETight-BI-AcGFP1、pTRE-Tight-BI-DsRed-Express)による遺伝子発現研究が可能である。

細胞株のスクリーニングが簡便

クローン細胞株のスクリーニングで、誘導時には高い発現レベルを実現し、かつ非誘導時に極めて低い基底発現レベルを維持するクローンを見い出すことは困難な作業だが、TREあるいはTREmodを含む両方向性ベクターを用いることでスクリーニングが簡易化される。 特に、TREmodを含むpTRE-Tight-BIベクターは、遺伝子の基底レベルの発現を低くすることにより遺伝子発現のより良い制御を確実にする。

発現レベルの迅速な検出

誘導時に蛍光レポータータンパク質を同時発現するベクターを用いれば、ドキシサイクリン添加に応答して発現した目的遺伝子の相対量を迅速に推測することが可能である。図2、3にpTRE-Tight-BIを用いて293 Tet-Off Cell Lineで2種類のタンパク質を誘導発現させた例を示す。(図2:ルシフェラーゼとDsRed2、図3:DsRed-ExpressとAcGFP1)。図2は、この反応が濃度依存的であり、2つのクローニングサイトのどちらを用いても発現に差がないことを示している。


図2. HEK 293 Tet-Off細胞におけるpTRE-Tight-BIベクターからのルシフェラーゼのドキシサイクリンに応答した濃度依存的発現
DsRed2およびルシフェラーゼ遺伝子を含むpTRE-Tight-BIベースの2つのプラスミド(pTRE-Tight-Red-BI-LucおよびpTRE-Tight-Luc-BI-Red)を作製した。pTRE-Tight-Red-BI-Lucでは、ルシフェラーゼ遺伝子をMCS Iサイトに、pTRE-Tight-Luc-BI-RedではMSC IIサイトにクローニングした。HEK 293 Tet-Off細胞内にこれらのベクターを別々に導入し、ドキシサイクリン濃度を変化させて48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。 誘導プロファイルから、pTRE-Tight-BIを用いると発現量および濃度依存的な反応性はどちらのクローニングサイトを選んでも影響を受けないことがわかる。注目すべきは、表1のようにTet-Off細胞株ではルシフェラーゼ発現が誘導されないベースラインのレベルがドキシサイクリンの10 ng/mlという低い濃度で維持されることである。

表1. 培地中のドキシサイクリン濃度とルシフェラーゼ活性(RLU)
ドキシサイクリン濃度(ng/ml) ルシフェラーゼ活性(RLU)
0 30,123 28,978
10-1 15,602 16,036
100 2,354 1,987
101 37 44
103 65 58
2×103 45 39
 



図3. 両方向性ベクターをトランスフェクトしたHEK 293 Tet-Off細胞
HEK 293 Tet-Off細胞に、2つのクローニングサイト(MCS I、II)にそれぞれDsRed-Expressおよび AcGFP1をクローニングしたpTRE-Tight-BIをトランスフェクトし、ドキシサイクリン(Dox)1 μg/mlの添加および非添加条件で培養して48時間後に蛍光顕微鏡を用いて視覚化した。
パネルA:AcGFP1はDoxの非添加条件で発現したが、Dox 1 μg/mlの添加条件では発現しなかった(パネルB、D)。パネルC:ドキシサイクリン非添加条件におけるAcGFP1およびDsRed-Expressの共発現

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