TaKaRa qPCR Norovirus (GI/GII) Typing Kit

ノロウイルスは急性胃腸炎の主要な原因ウイルスであり、感染の数日の潜伏期間後に、嘔吐、下痢、腹痛、発熱などの症状が現れる。感染源は、感染者の排泄物（便あるいは吐物）やノロウイルスを保有する二枚貝（カキなど）と推定されている。ノロウイルスはGenogroup I～Vの5つの遺伝子群に分類され、ヒトはGenogroup I（GI）とII（GII）に感染することが示唆されている。
TaKaRa qPCR Norovirus (GI/GII) Typing Kitは、厚生労働省 医薬食品局 食品安全部 監視安全課より通知された｢ノロウイルスの検出法について｣（平成15年11月5日付け食安監発第1105001号別添　最終改正：平成25年10月22日付け食安監発1022第1号）と同じ塩基配列のGI検出用およびGII検出用プライマーならびにプローブを使用したリアルタイムRT-PCR法によるノロウイルス検出キットである。
逆転写反応は、独自開発した逆転写酵素の使用により、15分で完了する。
増幅反応に用いるPremix Ex Taqは、抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素TaKaRa Ex Taq HSとリアルタイムPCR用に最適化されたバッファーの組み合わせにより、非特異的増幅を抑制し、高い増幅効率、高い検出感度でリアルタイムPCRを行うことができる。また、反応時間が極めて短い高速PCRに適している。
増幅産物の検出には、通知法と同じFAM（レポーター）／TAMRA（クエンチャ―）で標識されたプローブを採用している。プローブは、5'側を蛍光物質（FAMなど）、3'側をクエンチャー物質（TAMRAなど）で修飾したオリゴヌクレオチドである。アニール条件下では、プローブは鋳型DNAに特異的にハイブリダイズするが、蛍光はクエンチャーによって抑制されている。伸長反応時、Taq DNAポリメラーゼの持つ 5’→ 3’exonuclease活性により、鋳型DNAにハイブリダイズしたプローブが分解され、クエンチャーによる抑制が解除されることで蛍光を発する。この蛍光強度を測定することで増幅産物をモニターすることができる。

※本製品は、群馬県衛生環境研究所との共同研究の成果に基づき製品化しました。
　　論文はこちら（独立行政法人 科学技術振興機構サイト）
＊ 検便検体からのノロウイルス検出には、検便検査用のTaKaRaノロウイルスGI/GII検出キット（1液タイプ）Ver.2（製品コード RR204A）もしくはTaKaRaノロウイルスGI/GII検出キットVer.4（製品コード RC130A）をご利用ください。

RR250A（RT 50回分、GI反応 50回分^*1、GII反応 50回分^*1）

1．	5×PrimeScript Buffer (NV)*2,3	200 μl
2．	PrimeScript RT Enzyme Mix (NV)*2,4	50 μl
3．	Random 6 mers（100 μM）*2	50 μl
4．	Premix Ex Taq (NV)（2× conc.）*5	625 μl×2本
5．	GI Primer Mix*6	50 μl
6．	GII Primer Mix*6	50 μl
7．	GI Probe Mix*6,7	50 μl
8．	GII Probe Mix*6,7	50 μl
9．	ROX Reference Dye（50×conc.）*8	50 μl
10．	ROX Reference Dye II（50×conc.）*8	50 μl
11．	RNase Free dH2O	1 ml
12．	GI Positive Control DNA*9（4×106 copies/μl）	20 μl
13．	GII Positive Control DNA*9（4×106 copies/μl）	20 μl
14．	EASY Dilution (for Real Time PCR)*10	700 μl

*2　逆転写反応用試薬
*3　dNTP Mixture およびMg²⁺を含む。
*4　RNase Inhibitor を含む。
*5　TaKaRa Ex Taq HS、dNTP Mixture、Mg²⁺を含む。
*6　通知法と同じ塩基配列を採用
*7　蛍光標識プローブを含んでいるため、遮光に留意すること

• ROX Reference Dyeを添加する機種
  Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
• ROX Reference Dye IIを添加する機種
  Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
• 添加の必要がない機種
  Thermal Cycler Dice Real Time System III with PC（製品コード TP970）
  Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900/TP960）
  Thermal Cycler Dice Real Time System Lite（製品コード TP700/TP760）

*10　Positive Control DNAを段階希釈する際に、希釈溶液として使用する。

－20℃
Premix Ex Taq (NV)（2×conc.）は、いったん融解したものは4℃保存し、6ヵ月を目途に使用する。長期保存の場合は－20℃で凍結保存する。

【試薬】
RNA抽出試薬

【器具】

• 200 μl, 20 μl, 10 μl 各マイクロピペット
• マイクロピペット用チップ（疎水性フィルター付）

【機器】
リアルタイムPCR装置

• Thermal Cycler Dice Real Time System III with PC（製品コード TP970）
• Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900/TP960）^＊
  
• Thermal Cycler Dice Real Time System Lite（製品コード TP700/TP760）^＊
  

  ＊	チューブ1本ごとにフラットキャップが付いているキャップ付き8連チューブをThermal Cycler Dice Real Time System専用として販売している。チューブ間のコンタミネーションリスクを軽減できる。 0.1 ml 8-strip tube, individual Flat Caps（製品コード NJ902） 0.2 ml 8-strip tube, individual Flat Caps（製品コード NJ600）

• Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System
  Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）など

本製品に含まれるGI Positive Control DNAおよびGII Positive Control DNAは、タカラバイオで合成したノロウイルスの配列をもつプラスミドDNAである。通知法で用いられているG1、G2コントロールプラスミドDNAと同じ定量結果が得られるように濃度を調整しているので、通知法と同様の使用法が可能である。
EASY Dilution (for Real Time PCR) を用いて、GI Positive Control DNAおよびGII Positive Control DNAの10倍希釈系列を作製し、検量線を作成することで定量解析を行うことができる。定量可能な範囲は、得られたデータに基づいて判断する。

Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズ「食品環境検査用ソフトウェア」を使用の場合に便利な“Quick Manual”を用意している。
キットに添付の取扱説明書とあわせて使用する。

定量解析（絶対定量モード）用（PDF、993 K）

---

遺伝子検出・検査　関連試薬の選択フローをご利用ください

分野別の試薬選択フロー
手法別の試薬選択フロー

「遺伝子検査（食品・水質・家畜他）」関連のお役立ち情報専用ページもご参照ください。