本製品は、イルミナ社MiSeqで16S rRNA細菌叢解析を行うためのPCR増幅キットである。細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を対象とし、PCR酵素に、多様な配列を効率よく増幅可能なTks Gflex DNA Polymeraseを採用している。
V3-V4領域の増幅には使用実績の高い341F、806Rプライマーを採用しており（参考文献1、2、図1）、プライマーの5’側には、Illumina MiSeq用のoverhang配列が付加されている。本製品で増幅したPCR産物に、Nextera XT Index Kit（イルミナ社）のプライマーでシーケンスアダプターと検体ごとのシーケンスデータを識別するためのIndex配列を付加することにより、MiSeq用のライブラリーを調製する（図2）。

【注意】ライブラリー作製には本キットの他に以下の製品もご用意ください。

• Nextera XT Index Kit（イルミナ社）
• Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter社）

図1．16S rRNAの可変領域と本製品のPCR増幅領域


図2．ライブラリー作製のフロー

（50回）

1.	2×Gflex PCR Buffer (Mg2＋, dNTP plus)	1.25 ml
2.	Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 units/μl）	62.5 U（50 μl）
3.	16S V3-V4 Primer Mix（10×）	125 μl
4.	H2O	1 ml

・核酸抽出キット

[糞便試料の場合]
NucleoSpin DNA Stool（製品コード 740472.10/.50）など
[土壌試料の場合]
NucleoSpin Soil（製品コード 740780.10/.50/.250）など

PCR産物の精製

Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter社 Code. A63880/A63881/A63882）
0.2 ml 磁気スタンド：Magnetic Separator-PCR Strip（製品コード 635011）など
80％ エタノール
溶出液（10 mM Tris-HCl, pH8.5）

・シーケンスアダプターとIndex配列の付加

Nextera XT Index Kit（イルミナ社 Code. FC-131-1001/FC-131-1002）
Nextera XT Index Kit v2 set A-D（イルミナ社 Code. FC-131-2001～2004）

・サーマルサイクラー

TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch（製品コード TP350）
TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient（製品コード TP600）など

・アガロース電気泳動装置

Mupid-2plus（製品コード M-2P）
Mupid-exU（製品コード EXU-1）など

・アガロースゲル

Agarose L03「TAKARA」（製品コード 5003/5003B）
PrimeGel Agarose PCR-Sieve（製品コード 5810A）など

・微量高速遠心機

・マイクロピペットおよびチップ

－20℃