肺cDNAライブラリー

メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR 9506 9506 cDNA Library, Human Lung
5 μg ¥110,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

本製品は、各種polyA+ RNAからリンカープライマー法1)により作製したプラスミドDNA型cDNAライブラリーである。制限酵素 Not I 認識部位を有するoligo(dT)18リンカープライマーとBamH I(Bgl II)-Sma Iアダプターを用いて、unidirectional cloning している。クローニングの前にはサイズ分画を行い、約300 bp以下の断片をある程度除去している。ライブラリーは、プレート培養法により1度だけ増幅した菌体から、プラスミド抽出キットを使用して調製している。

クローニングベクター

cDNAライブラリーに使用しているベクター pAP3neo は、Okayama-Bergベクター(pCD2) をもとにして作製された2) もので、SV40プロモーターを有し、哺乳動物細胞で発現可能である。また、ssDNA生成に必要なf1 oriin vitro RNA合成のためのT7およびT3 RNAポリメラーゼプロモーターを含んでいる(図1)。
GenBank Accession No. AB003468

pAP3neoの構造

図1 pAP3neoの構造

クローニングサイト

1) Insert cDNAは、pAP3neoBgl II */ Not Iサイトにクローニングしている。
* Adaptor, BamH I(Bgl II)-Sma Iを用いてクローニングしているため、クローニング後のBgl IIサイトは潰れている。

2) Xba Iサイトは、dam methylaseの影響を受けている。

用途

新規あるいは既知のcDNAのPCRによるスクリーニング

製品内容

容量:5 μg
形状:10 mM Tris-HCl(pH8.0), 1 mM EDTA
濃度:200 μg/ml

ライブラリー作製法

ヒト各種臓器由来のpolyA+ RNAよりリンカープライマー法1)を利用して以下の手順で各cDNAライブラリーを作製している(図2)。
制限酵素Not I認識部位を有するoligo(dT)18リンカープライマーとBamH I(Bgl II)-Sma Iアダプターを用いてunidirectional cloningしているが、制限酵素Not I処理からcDNAを保護するため、逆転写酵素(RAV-2由来)による第一鎖cDNA合成時に5-methyl dCTPを取り込ませている。第二鎖cDNA合成、末端平滑化の後、アダプターを付加し、制限酵素Not Iで切断している。遊離のアダプターと短いcDNA断片は、クローニングの前のサイズ分画によりある程度除去している。サイズ分画されたcDNAはNot Iサイト側のみリン酸化されており、一方、ベクターは、制限酵素Not Iで切断した後、脱リン酸化処理を行い、制限酵素Bgl IIで切断しているので、ベクターはBgl IIサイトのみリン酸化されていることになる。
これにより、cDNAとベクターとのライゲーションの際に、複数のcDNAがベクターに挿入されたり、ベクター同士が連結する可能性を低減させている。cDNAとベクターを連結した後、XL1-Blue MRF′を宿主としてエレクトロポレーション法により形質転換を行うことによりcDNAライブラリーを作製している。作製したライブラリーは、液体培養法ではなく、プレート培養法により一度だけ増幅しているため、プライマリーライブラリーのポピュレーションがほぼ保たれている。
プラスミド型cDNAライブラリーは、一度だけ増幅した菌体からプラスミドDNAを抽出精製して調製している。
cDNAライブラリー作製法

図2 cDNAライブラリー作製法1)

mRNA Source

対応するCertificate of Analysis(CoA;製品に添付)をご覧ください。
CoAはタカラバイオウェブサイトのドキュメントセンターでもダウンロードできます。
(URL: http://catalog.takara-bio.co.jp/search/doc_index.php

cDNAライブラリーの品質

cDNAライブラリーの品質データを下表に示す。
弊社では、すべてのライブラリーについて以下のテストを行っている。
I.増幅前のクローン数
II. インサートDNAの確認
クローニング後の平均インサートサイズを、ランダムに拾った15個のコロニーのインサートサイズから求めている。
III. Housekeeping geneのPCRによる増幅
各cDNAライブラリーのプラスミドDNA 10 ngをテンプレートとしたPCRにより、次の3種類のcDNAの5'端付近の約1 kbを増幅して検出している。

  1. β-actin(全長約1.7 kb、発現量:high level)
  2. glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
    (全長約1.2 kb、発現量:moderate level)
  3. transferrin receptor
    (全長約5.0 kb、発現量:low level)

cDNAライブラリー 製品コード Primary Library Size1)
(Independent clone)
Avr. cDNA Size2)
(クローニング後)
Human Lung 9506 3.0×106 1.0 kb or larger

1) Primary Library Size(Independent clone) 増幅前のclone数
2) クローニング後のAverage Insert Size ランダムに拾った15個のコロニーのinsert sizeの平均値

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