肺cDNAライブラリー

メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR 9543 9543 cDNA Library, Rat Lung
5 μg ¥110,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

本製品は、polyA+ RNAからリンカープライマー法1)により作製したプラスミドDNA型cDNAライブラリーである。制限酵素 Not I 認識部位を有するoligo(dT)18リンカープライマーとBamH I(Bgl II)-Sma Iアダプターを用いて、unidirectional cloningしている。クローニングの前にサイズ分画を行い、約300 bp以下の断片をある程度除去している。ライブラリーは、プレート培養法により1度だけ増幅した菌体(>1.0×107 cfu/ml)からプラスミド抽出キットを使用して調製している。

クローニングベクター

cDNAライブラリーに使用しているベクター pAP3neo は、SV40プロモーターを有し、哺乳動物細胞で発現可能である。また、ssDNA生成に必要なf1 oriin vitro RNA合成のためのT7およびT3 RNAポリメラーゼプロモーターを含んでいる(図1)。
GenBank Accession No. AB003468

pAP3neoの構造

図1 pAP3neoの構造

クローニングサイト

1) Insert cDNAは、pAP3neoBgl II */ Not Iサイトにクローニングしている。

* Adaptor, BamH I(Bgl II)-Sma Iを用いてクローニングしているため、クローニング後のBgl IIサイトは潰れている。

2) Xba Iサイトはdam methylaseの影響を受けている。

用途

新規あるいは既知のcDNAのPCRによるスクリーニング

製品内容

容量:5 μg
形状:10 mM Tris-HCl(pH8.0), 1 mM EDTA
濃度:200 μg/ml

ライブラリー作製法

ラット各種臓器由来のpolyA+ RNAよりリンカープライマー法1)を利用して以下の手順で各cDNAライブラリーを作製している(図2)。制限酵素Not I認識部位を有するoligo(dT)18リンカープライマーとBamH I(Bgl II)-Sma Iアダプターを用いてunidirectional cloningしているが、制限酵素Not I処理からcDNAを保護するため、逆転写酵素(RAV-2由来)による第一鎖cDNA合成時に5-methyl dCTPを取り込ませている。第二鎖cDNA合成、末端平滑化の後、アダプターを付加し、制限酵素Not Iで切断している。遊離のアダプターと短いcDNA断片は、クローニングの前のサイズ分画によりある程度除去している。サイズ分画されたcDNAはNot Iサイト側のみリン酸化されており、一方、ベクターは、制限酵素Not Iで切断した後、脱リン酸化処理を行い、制限酵素Bgl IIで切断しているので、ベクターはBgl IIサイトのみリン酸化されていることになる。これにより、cDNAとベクターとのライゲーションの際に、複数のcDNAがベクターに挿入されたり、ベクター 同士が連結する可能性を低減させている。cDNAとベクターを連結した後、XL1-Blue MRF′を宿主としてエレクトロポレーション法により形質転換を行うことによりcDNAライブラリーを作製している。作製したライブラリーは、液体培養法ではなく、プレート培養法により一度だけ増幅しているため、プライマリーライブラリーのポピュレーションがほぼ保たれている。プラスミド型cDNAライブラリーは、一度だけ増幅した菌体からプラスミドDNAを抽出精製して調製している。
cDNAライブラリー作製法

図2 cDNAライブラリー作製法1)

mRNA Source

Pooled from 100 Sprague-Dawley outbred males, ages 10-11 weeks

cDNAライブラリーの品質

cDNAライブラリーの品質データを下表に示す。
弊社では、すべてのライブラリーについて以下のテストを行っている。
I. 増幅前のクローン数
II. インサートDNAの確認
クローニング後の平均インサートサイズを、ランダムに拾った15個のコロニーのインサートサイズから求めている。
III. Housekeeping geneのPCRによる増幅
各cDNAライブラリーのプラスミドDNA10 ngをテンプレートとしたPCRにより、次の3種類のcDNAを増幅して検出している。

  1. β-actin
    (発現量:high level)
  2. glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
    (発現量:moderate level)
  3. transferrin receptor
    (発現量:low level)

cDNAライブラリー 製品コード Primary Library Size1)
(Independent clone)
Avr. cDNA Size2)
(クローニング後)
Rat Lung 9543 7.2×106 1.4 kb

1) Primary Library Size(Independent clone) 増幅前のclone数
2) クローニング後のAverage Insert Size ランダムに拾った15個のコロニーのinsert sizeの平均値

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