NGSライブラリーの精製、サイズ分画に

NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select

  • 磁性ビーズを用いたNGSライブラリーの精製、サイズ分画
  • 少量(17.5 pg)サンプルから利用可能
  • 150~800 bpのサイズ分画が可能
  • さまざまなNGS applicationに容易に対応
  • 手動と自動化装置のどちらにも対応
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
MNA 744970.5 U4970A NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
5 ml ¥15,000
説明書・データシート・ベクター情報
MNA 744970.50 U4970B NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
50 ml ¥68,000
説明書・データシート・ベクター情報
MNA 744970.500 U4970C NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
  • 取寄
500 ml ¥520,000
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製品説明

NucleoMag NGS Clean-up and Size Selectは、NGSライブラリー作製において、1回または2回のサイズ分画によりDNA断片を精製すると同時に目的サイズのDNA断片を回収するためのキットである。本製品の磁性ビーズは、結合バッファーに懸濁されており、目的のDNA断片サイズに合わせて希釈率を調整して使用する。希釈率は一般的に使用される精製用のビーズを使用する場合と大きな違いはなく、NGSライブラリー調製キットのプロトコールに容易に組み込むことが可能である。

原理 磁性ビーズ法
形状 高反応性超常磁性ビーズ
操作 手動または自動化装置
サンプル種 NGSライブラリーの作製途中の反応液
サンプル量 17.5 pg~5 μg
サンプル液量 50~150 μl
回収量 >80%
溶出液量 10~100 μl

DNA断片のサイズ選択
図1.DNA断片のサイズ選択
より大きなサイズまたは小さいサイズのDNAのどちらかを除去するサイズ分画では、サンプルをあらかじめ定めた比率でビーズと混合する(混合比率とサイズ分画のだいたいの大きさは下図参照)。より大きなサイズと小さいサイズの断片をカットオフする、特定サイズ領域のみのDNA分画の場合は異なった混合比率での2回の結合ステップを含む精製を行う。

さまざまなサイズ断片の回収率
図2.さまざまなサイズ断片の回収率
DNAサイズ分画のため、各100 μl DNA溶液 (10 ng/μl)に図に示される比率(ratio=ビーズ:DNA)となるようにNucleoMag NGS Clean-up and Size Selectビーズを加えて精製を行い、各DNA断片の回収率を算出した。DNAは、100~1,000 bpサイズの混合物を使用した。

両側サイズ選択
図3.両側サイズ選択
マウス組織由来のゲノムDNAを断片化後、違った比率のNucleoMag NGS Clean-up and Size Selectを使用してサイズ分画を行った。
緑:断片化DNAのサイズ分布
赤:ビーズ比率が0.4と0.6でのサイズ分画後のライブラリーサイズ分布(平均サイズ:460 bp)
青:ビーズ比率が0.55と0.8でのサイズ分画後のライブラリーサイズ分布(平均サイズ:340 bp)

短鎖DNAの除去
図4.短鎖DNAの除去
100~1,000 bpサイズのDNA混合物をアダプターダイマー除去のプロトコールに従ってサイズ分画を行い精製した。100~200 bpの大きさのDNA断片が取り除かれていることが示された。

NGSライブラリーからのサイズ分画
図5.NGSライブラリーからのサイズ分画
大腸菌DNAをサンプルに、TruSeq DNA PCR Free kit(Illumina社)を用いてNGS用のライブラリーを作製した。その際、DNA精製とサイズ分画は、A社磁性ビーズ(赤)、B社磁性ビーズ(青)、NucleoMag NGS Clean-up and Size Select(緑)を使用した。図Aは、精製前の断片化E. coli DNA(1 μg)を示す。図Bは、ライブラリー調製後のDNA断片の分布を示す。


サイズ分画後のシーケンス解析
図6.サイズ分画後のシーケンス解析
図5で作製されたライブラリーを用いて実際に塩基配列解析を行い、各磁性ビーズ精製で塩基配列結果を比較した。塩基配列解析はTruSeq Rapid SBS Kit(Illumina社)を用いて、HiSeq2500で解析を行った。
A.得られた塩基配列を大腸菌ゲノムにマッピングを行い、各塩基の解析数(depth)を比較した。3つの磁性ビーズで、グラフの形状はほぼ一致しており、ゲノム全体で解析結果に差は見られなかった。
B.塩基配列解析のGC比率の影響を確認するため、横軸にGCの比率、縦軸に各ビーズ精製のライブラリー由来のread depthの比率をプロットした。3つの精製ビーズで、GCによるバイアスの違いは見られなかった。

内容

・NucleoMag NGS Bead Suspension

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

・80%エタノール
・Elution buffer(10 mM Tris-HCl(pH 8)またはH2O)
・ピペットチップ(滅菌済)
・ピペット
・磁気ビーズセパレーター
    NucleoMag SEP(製品コード 744900)
・磁気ビーズの分離用プレート
    96-well 0.3 mL microtiterplate(Elution Plate U-bottom; 製品コード 740486.24)
・プレートシール
    Self-adhering PE Foil(製品コード 740676)

保存

4℃

操作手順

2回のサイズ分画による特定の大きさのDNAの精製

* 磁性ビーズ溶液と試料の混合比率(0.4 or 0.6)については、分画したいDNAの大きさや試料の組成に応じて適切に設定してください。

用途

  • NGSライブラリーキットにおける精製やサイズ分画
  • 次世代シーケンスのサンプル調製
NucleoMagはマッハライ・ナーゲル社の登録商標です。

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