Heparan Degrading Enzyme Assay Kit

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略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR MK412 MK412 Heparan Degrading Enzyme Assay Kit
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • バルクなど特別対応可能
96回 ¥86,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

ヘパラン硫酸はbFGF(塩基性繊維芽細胞増殖因子)と結合する性質があり、FGFとそれらの分子との親和性を検討した研究が報告されている。しかし、ヘパラン硫酸がヘパラン硫酸分解酵素によって分解されると、bFGFとの結合性は失われる。つまり、未分解のヘパラン硫酸はbFGFに結合するが、その分解物はbFGFに結合しない。したがって、ヘパラン硫酸を基質として、サンプル添加とサンプル無添加(対照)の2つの条件で反応を行った後、 bFGFに結合した未分解ヘパラン硫酸の量を比較定量すれば、サンプル中のヘパラン硫酸分解酵素の活性を測定することができる。
本キットは、この原理を利用してヘパラン硫酸分解酵素の活性をnon-RIで測定するキットで、未分解ヘパラン硫酸を捕捉するために、抗ヒト・フィブロネクチン抗体(CBD-FGFのCBD部分に結合する)をコーティングした96ウェルプレート上に固定化したCBD-FGF(ヒト・フィブロネクチンCell Binding DomainとヒトFGFの融合タンパク)を用いている(Domain Oriented Capture法;DOC法)。そのため、未分解ヘパラン硫酸と自然な形で結合できるようにFGFの立体構造が保持される。
一連の測定に要する時間は、最短で約100分である。なお、使用する反応緩衝液にはプロテアーゼインヒビターやグルクロニダーゼ・インヒビターが添加されているので、非特異的な分解は抑えられる。
ヘパラン硫酸分解酵素活性と癌の転移・浸潤性との相関性が報告されており、癌の転移・浸潤性の研究やインヒビターのスクリーニングに本キットは有用である。

内容

1. CBD-FGF固相化96ウェル分離型マイクロタイタープレート1枚(8 well×12 strips)
2. ビオチン化ヘパラン硫酸(ラベル化基質)(凍結乾燥品)5.5 ml用
3. 希釈用反応緩衝液11 ml
4. 細胞抽出用緩衝液11 ml
5. 活性標準品(細胞抽出物由来活性画分)(活性はロットごとに記載)250 μl用
6. ぺルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン11 ml用
7. 発色基質12 ml
注意:反応停止液(1 N 硫酸)は含まれていませんので、発色前に必ず自家調製してください。

保存

4℃

特長

  • 放射性同位元素を使用しない。
  • 96ウェルプレートを用いるため、多数の検体処理が可能。
  • 酵素の由来動物は問わず、どんな動物組織、細胞、血清でも使用できる。
  • bFGFとヘパリン様物質やその他の親和性物質の相互作用の研究に応用できる。

ヘパラン硫酸分解酵素とは

ヘパラン硫酸は、哺乳類に普遍的に存在する多糖で、タンパク質と結合したプロテオグリカンの形で細胞膜成分として分布している。主な機能としては、毛細血管内皮細胞表面におけるリポタンパク質リパーゼのアンカーの役割や、細胞の特異性発現、増殖の調節、相互認識、細胞浸潤の防護、細胞間接着などへの関与があげられるが、ヘパリンと異なり抗血液凝固活性はない。
ヘパラン硫酸分解酵素(ヘパラナーゼ)は、ヘパラン硫酸のβ-D-glucronosyl-N-acetylglucosaminyl結合を特異的に切断するエンドβ-D-グルコシダーゼで、哺乳類の肝、脾、皮膚、胎盤、血小板でその活性が認められている。また、メラノーマ、リンパ腫、サルコーマ、線維肉腫、結腸癌のような腫瘍組織でその活性が報告されており、ガン細胞の悪性度との相関についてさまざまな研究がなされてきている1~4)。例えば、転移・浸潤性の高いガン細胞では、転移・浸潤性の低いガン細胞よりもヘパラン硫酸分解酵素活性が高いという報告がある1, 2)

ヘパラン硫酸分解酵素活性の活性測定法として、これまで次のような方法が用いられてきた。
  1. 35S]ラベルしたヘパラン硫酸を基質として反応を行い、Sephacryl S-200でゲルろ過し、低分子画分の放射能を調べる方法4)
  2. 未分解のヘパラン硫酸はHRG(ヒスチジンリッチグリコプロテイン)に結合するが、分解物は結合しないという性質を利用して、[3H]ラベルしたヘパラン硫酸を基質として反応を行った後に、分解物に由来する放射能のみを測定する方法5)
いずれの方法も、ラジオアイソトープ(RI)を使用しなければならないという制約があることや大量のサンプルを処理できないこと、あるいは、HRGを使用する系では、細胞の培養上清をサンプルとして使用できない(血清中のHRGにより測定が妨害されるため)など、いくつかの不都合があった。

測定原理

  1. サンプルまたは活性標準品(0濃度も含む)を通常の96穴プレート(またはマイクロチューブ)に加え、これに基質としてビオチン化ヘパラン硫酸を加え、分解反応を行う。
  2. この反応産物をCBD-FGF固定化96穴プレートに加え、未分解のビオチン化ヘパラン硫酸を固相化CBD-FGFで捕捉する。
  3. 未結合の分解物を洗浄除去した後、ぺルオキシダーゼ(POD)標識ストレプトアビジンを加え、CBD-FGFに捕捉された未分解のビオチン化ヘパラン硫酸のビオチン部分に結合させる。
  4. 洗浄後、PODの基質TMBZを加えて呈色反応を行い、1 N硫酸で反応を止めた後、450 nmにおける吸光度を測定する。この発色は、未分解のヘパラン硫酸に由来するため、本法では、吸光度の減少を測定することにより、サンプル中のヘパラン硫酸分解酵素の活性を求める。

性能

(1) 検出感度
0.1 U/ml 以上で検出可能。
測定範囲(典型的な検量線の例を以下に示す。しかし、検量線は測定ごとに作成しなければならない。)

Activity(U/ml) 4.20 2.10 1.05 0.525 0.262 0.131 0.065 0.00
OD450 0.542 0.748 1.242 1.702 2.173 2.360 2.459 2.822

(2) 再現性
【同時再現性】R3種類の細胞抽出物を用いて同時再現性試験を実施した(n=8)。

Average(U/ml) SD CV(%)
サンプルA 0.764 0.044 5.8
サンプルB 1.158 0.041 3.5
サンプルC 1.708 0.052 3.1

注意

本製品は研究用試薬です。ヒト、動物への医療、臨床診断には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品などとして使用しないでください。

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