トランスファクターキット(発色法)

  • DNA-タンパク質間相互作用を検出する特異性の高いアッセイ
  • ゲルシフトアッセイより迅速かつ高感度
  • 96ウェルプレート形式でハイスループットに対応
  • RIを用いずに発色法(あるいは化学発光法)で検出可能
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 631916 Z1916N TransFactor NFκB p50 Colorimetric Kit
96回 ¥173,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 631939 Z1939N TransFactor Family Colorimetric Kit-HIF 1α,β
96回 ¥206,000
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CLN 631949 Z1949N TransFactor NFκB p52 Colorimetric Kit
96回(1プレート) ¥173,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 631953 Z1953N TransFactor Colorimetric Kit-STAT3
96回(1プレート) ¥173,000
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CLN 631936 Z1936N TransFactor Profiling Kit-Oncogenesis 1
96回 ¥224,500
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CLN 631938 Z1938N TransFactor Profiling Kit-Oncogenesis 3
96回 ¥224,500
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CLN 631946 Z1946N TransFactor Whole Cell Extraction Kit
1 Set ¥37,100
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TransFactor KitはELISAを利用して転写因子とDNAの結合を検出する迅速で高感度な方法である(図1)。ゲルシフトアッセイより迅速、容易、高感度で、3~4時間で多数の実験を行うことができ、RI標識の必要がない。1つの転写因子を詳細に研究するために設計されたTransFactor Kit、ならびに最高6種類の転写因子を同時に検出可能なTransFactor Profiling Kit(表1)の2種類のタイプの製品を用意している。


図1. 高感度な酵素免疫測定法により転写因子活性を測定するTransFactor Kit

表1. 各TransFactor Profiling Kitが検出可能な転写因子
Onc 1 Onc 3
(製品コード 631936) (製品コード 631938)
DP-1c/EBPα
E2F-1Egr-1
E2F-2HIF-1α
RbHIF-1β
p107Oct I
Sp1 Oct II

TransFactor Kitの原理

TransFactor Profiling Kitは、種々の細胞株や組織における転写調節の研究や薬剤標的の探索に理想的である。各キットには6種類の転写因子のDNA結合動態を測定する96穴プレートが付いている(図1)。各ウェルは特定の因子のDNAコンセンサス結合配列があらかじめコートされている。アッセイでは、哺乳類細胞の核抽出液や細胞抽出液をウェルに加え、転写因子がコンセンサス配列に結合するまでインキュベートする。非結合タンパク質を洗い流した後、転写因子に特異的な一次抗体を加える。次に、HRP標識二次抗体を加え、HRP基質とインキュベートして発色強度を測定する。

多因子のプロファイルまたは1因子の詳細な研究

個別形式のTransFactorキットでは、80ウェルに特定の転写因子に対応する野生型シス作用性DNA配列がコートされており、残りの16ウェルにはネガティブコントロールとして用いる変異型シス作用性DNA配列がコートされている(図2のパネルA)。Profiling Kitではプレート全体を使用して関連するどのような転写因子でも検出できる(抗体で各転写因子を区別します)。弊社のプロファイリングキットで使用するプレートは、16ウェルずつ6セットに分割可能である。色分けされた各セットは、各種転写因子に対応する野生型シス作用性DNA配列がコートされている(図2のパネルB)。TransFactor Plateは分割可能なウェルから構成されているので、多様な実験計画に合わせてプレートの配置を変えることができる。96ウェルをすべて同時に反応させたり、一部のウェルのみを外して使用することも可能である。


図2. 転写因子の研究をハイスループット形式で迅速かつ容易にするTransFactor Kit
個別形式のTransFactorプレート(パネルA)には、特定の転写因子が認識する配列を含むdsDNAオリゴがコートされている。赤色のウェルは変異型オリゴがコートされており、ネガティブコントロールとして使用する。Profilingプレート(パネルB)は6セットの色分けされたウェルに分割可能である。各セットは特定の転写因子に対応するコンセンサス配列がコートされている。

転写因子の量に比例する結果

各ウェルで検出されるシグナル強度はプレートに結合した転写因子の量に相関する。転写因子を含む核抽出液の量を増やすとシグナルが増大する。独自の設計により、96反応をすべて同時に実施したり、個別またはストリップ別にウェルを外して後で使用することもできる。競合オリゴの添加によるシグナル低下は、この相互作用が特異的であることを示している。定量的な結果が得られるため、精製した転写因子を用いて標準曲線を作製することができる。
プロファイリングキットは種々の刺激で処理した細胞株における複数の転写因子を検討したり、異なる種類の細胞に存在する転写因子の相対量を比較する場合に極めて有用である。(図3、4)


図3. 異なるHeLa細胞の核抽出液に存在する複数の転写因子をプロファイル
NFκB p50、NFκB p65、c-Rel、c-Fos、CREB-1、ATF2に対応する野生型dsDNAをコートしたウェルに、未処理またはTNFαやPMAで誘導処理した3つの異なるHeLa細胞の核抽出液を加えた。その後、ユーザーマニュアルの説明に従って、対応する一次抗体を用いて検出した。データは2つの値の平均値±SDで示している。変異型オリゴでは結合が認められなかった(データ省略)。


図4. TransFactor NFATc1 Colorimetric Kitを使用したNFATc1の用量作用曲線および競合アッセイ
フィトヘムアグルチニン(PHA)で処理したJurkat細胞の全細胞抽出液の濃度を段階的に増大させると、シグナルも増大した。野生型の競合オリゴによって、結合シグナルは減少した。結合アッセイには30 μgの全細胞抽出液を使用した。

細胞抽出液や核抽出液の簡便な調製法

簡便、迅速に細胞質抽出液を調製する場合にはTransFactor Whole Cell Extraction Kit(製品コード 631946)をお勧めする。キットには1~5×107個の哺乳類細胞から140反応分を抽出するのに十分量の試薬類が含まれている。

保存

製品添付のCertificate of Analysisの記載に従って、適切に保存してください。

US取扱説明書

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