簡単操作で5 kbまでのノックインドナー用一本鎖DNAが調製可能

Guide-it™ Long ssDNA Production System

  • CRISPR/Cas9ノックインドナー用長鎖一本鎖DNA(ssDNA)調製キット
  • 500 bases~5 kbまでのssDNAが調製可能
  • 独自技術の「Strandase処理」で二本鎖を一本鎖化
  • クローニング操作、ゲル抜き精製不要の簡単プロトコール
  • 二本鎖DNAに比べてランダムインテグレーションが少ないため、ゲノム編集効率がUp
Guide-it Long ssDNA合成キット
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別)
キャンペーン価格
特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 632644 Z2644N Guide-it™ Long ssDNA Production System
  • New
  • 導入システム編
  • ライセンス
25回 ¥75,000
¥60,000
2017/07/03~
2017/08/31

説明書・データシート・ベクター情報
CLN 632645 Z2645N Guide-it™ Long ssDNA Strandase Kit
  • New
  • 導入システム編
  • ライセンス
25回 ¥60,000
¥48,000
2017/07/03~
2017/08/31

説明書・データシート・ベクター情報

※色文字での表示は、キャンペーン価格およびそのキャンペーン期間です。

製品説明

CRISPR/Cas9でのノックインはドナーDNAを作製し、主にCas9-sgRNA複合体もしくはCas9-sgRNA発現ベクターと共に導入することで起こる。
ドナーDNAは、二本鎖DNA(dsDNA)より一本鎖DNA(ssDNA)を使用する方が多くの利点があることが近年示されているが、長鎖のssDNAは作製が難しいため使用が制限されていた。
Guide-it Long ssDNA Strandase Kit(製品コード 632645)は、500 basesから5 kbまでの長鎖ssDNAが調製でき、CRISPR/Cas9のノックインドナー用DNAとして使用できる。
本キットには ssDNAを50回(センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ25回)作製するために必要な試薬が含まれている。
独自技術のStrandase処理により、PCR産物のセンス鎖またはアンチセンス鎖を選択的に分解し、簡便な方法で最終的にセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のssDNAが調製できる。
Guide-it Long ssDNA Production System(製品コード 632644)はGuide-it Long ssDNA Strandase Kit(製品コード 632645)とssDNA精製用のNulceoSpin Gel and PCR Clean-up(製品コード 740609.50)がセットになった製品である。

相同組換え(HDR)実験に使用するための長鎖ssDNA作製のフロー
図1.相同組換え(HDR)実験に使用するための長鎖ssDNA作製のフロー

まず、dsDNAテンプレートをクローニング、fusion PCR、または他の方法により調製する。テンプレートは目的遺伝子の他に、目的遺伝子を挿入する左右の隣接配列と相同のアームを含む必要がある。
次に、dsDNAテンプレートを片側のみリン酸化プライマーを使用してPCRを行い、異なる2種類のdsDNA産物を作製する(これらはそれぞれ、センス鎖ssDNA、アンチセンス鎖ssDNA作製のための鋳型となる)。
Strandase Mix Aを加えてセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を分解する。Strandase Mix Aは5’がリン酸化された鎖だけを分解するので、センス鎖側またはアンチセンス鎖側を選択的に分解できる。次にStrandase Mix Bを加えて最終の分解を行い、ssDNAが得られる。
得られたssDNAをクリーンアップし、CRISPR/Cas9でのノックイン実験に使用する。
センス鎖、アンチセンス鎖両方のssDNAを調製し、それぞれ別々にノックイン実験を行うことを推奨する。

Cellartis human iPS cell line 18(ChiPSC18)の挿入サイト変異の確認
図2.Cellartis human iPS cell line 18(ChiPSC18)の挿入サイト変異の確認

AAVSにあるターゲットサイトのホモロジーアーム(600 bp)を含んだEF1αプロモーターおよびAcGFP1を含むssDNAドナーを作製し、ノックイン実験を行った。
GFP陽性クローンを単離した後、挿入されたサイトの正確性を調べるためにシーケンスを行った。その結果、すべてのクローンで目的遺伝子が正しい位置に挿入され、つなぎ目に変異が入っていないことが確認できた。

dsDNAテンプレートからのssDNAの作製
図3.dsDNAテンプレートからのssDNAの作製

Panel A:GAPDHまたはTyr geneへAcGFP1を挿入するための長鎖ssDNAを作製した。
一部のssDNAは、本来あるべきssDNAの長さより多少短くなっていた。
Panel B:CCR5 locus用の2-5kbまでのssDNAの作製を行った。

HEK293細胞のGAPDHのC末端領域へのAcGFP1のノックイン
図4.HEK293細胞のGAPDHのC末端領域へのAcGFP1のノックイン

Panel A: GAPDHのexon 8領域にGAPDHとインフレームで融合するようにAcGFPを挿入するためのドナーssDNAテンプレートを本キットを使って作製した。
Panel B: HEK293細胞へ変異導入後のフローサイトメトリーの結果を示した。
直鎖状のdsDNAをドナーとして使用した場合は、Cas9とsgRNAの非存在下でも緑色の蛍光が観察された。一方センス、アンチセンス鎖のドナーssDNAテンプレートを使用した場合は、テンプレートがCas9とsgRNAが共に導入された場合のみ、蛍光が観察され、Cas9とsgRNA非存在下では、ほとんど蛍光は観察されなかった。

ellatis hiPSC18を用いたノックイン実験でのdsDNAおよびssDNAドナーテンプレートの細胞毒性の比較
図5.Cellatis hiPSC18を用いたノックイン実験でのdsDNAおよびssDNAドナーテンプレートの細胞毒性の比較

hiPSC18の、tubulin領域にAcGFP1をノックインするssDNA、もしくはdsDNAをCas9と一緒に、をエレクトロポレーションで導入した。Cas9を加えない場合も同時に行った。
ドナーテンプレートは、インサートの両側に350 bの相同アームを持つ構造で長さは約1.5 kbである。dsDNAドナーを用いた場合は、Cas9存在下・非存在下どちらにおいても顕著な毒性が見られた。

内容

Guide-it Long ssDNA Production System(製品コード 632644)
  • Guide-it Long ssDNA Strandase Kit(製品コード 632645)
    PrimeSTAR Max Premix (2X)625 μl×4
    Strandase Mix A250 μl
    Strandase A Buffer (10X) 250 μl
    Strandase Mix B50 μl
    Strandase B Buffer (2X)1.25 ml×2
    RNase Free Water1 ml×5
  • NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit(製品コード 740690.50)   50回×2

保存

Guide-it Long ssDNA Strandase Kit(製品コード 632645)-20℃
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(製品コード 740690.50)室温

本製品以外に必要な試薬(主なもの)

ターゲット増幅用プライマー
(5’リン酸化プライマー 2種類、通常のプライマー 2種類 計4種類必要)

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注意事項
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