ハイスループットの遺伝子発現量カウンティングに特化したcDNA調製キット

SMART-Seq® v4 3' DE Kit

  • SMART-Seq v4ベースなので、1細胞やtotal RNA 10 pgといった超微量サンプルにも対応可能
  • 3'末端情報のみを解析することで低コストでのハイスループット遺伝子発現差解析を実現
  • 最大12サンプルをまとめてライブラリー調製ができるため、操作時間や試薬コストの低減が可能
RNA-Seq解析関連製品
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 635040 Z5040N SMART-Seq® v4 3' DE Kit
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
96回 ¥680,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 635041 Z5041N SMART-Seq® v4 3' DE Kit
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
192回 ¥1,200,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

単一細胞からのトランスクリプトーム解析は、集団中の各細胞がどのような遺伝子発現しているかを理解する上で重要である。SMART-Seq v4 3' DE Kitでは、単一細胞由来のmRNA転写産物の3’端配列情報が網羅的に得られるため、遺伝子発現差解析(Differential gene Expression (DE) analysis)に適している。本製品は、SMART法とLNA技術を取り入れたSMART-Seq v4キットの特徴を取り入れた製品である。
mRNAの3'端配列を集中的にシーケンスすることに加えて、本製品は、Read 2上にバーコードとして使用できるインデックスを含んでいるため、12サンプルまとめてライブラリー調製ができ、シーケンスできる。RNAサンプル量は、1~10.5 μlまでInput可能で、作製したcDNAは直接、イルミナ社 Nextera XT DNA Sample Prep Kit*1でライブラリー作製*2でき、HiSeq、NextSeq*3、MiSeq、MiniSeq*3などのイルミナ社NGSシーケンサーで解析できる。

*1断片化とタグ付加のために、イルミナ社Nextera XT DNA Sample Prep Kitが別途必要です。
*2ライブラリーのインデックスの種類は理論上最大で1,152(=12×96)まで可能です。
*3NextSeq、およびMiniSeqでシーケンスを行う際には、サンプルにControl DNA(PhiX)を加えて解析してください。
SMART cDNA合成とライブラリー作製
図1.SMART cDNA合成とライブラリー作製
ブロック付oligo(dT)プライマーを使用してcDNA合成する。プライマーには、以降の増幅や解析に利用する配列、in-line index、Illumina read primer 2配列(RP2)、とSMART IIA配列が含まれる。SMART IIA配列はcDNA増幅のため、Illumina RP2配列はライブラリー増幅のため、in-line indexはプールしたサンプルの解析のために使用される。
SMARTScribe逆転写酵素とSMART-Seq v4 Oligonucleotideを用いてcDNA合成する。 合成cDNAをBlocked Primer IIAオリゴでPCR増幅する。12サンプルまでをプールした後、断片化し、(TnRP1、RP2配列を含む)Illumina Nextera read primer 1と2を加える。mRNAの3'端はTnRP1とRP2配列に対するプライマーを用いた選択PCRにより濃縮される。このPCR反応時に、クラスター配列とindex配列が付加され、イルミナ社シーケンサー解析で利用される。

Sample ID Pool In-line Indexes
i1
i2
i3
i4
i5
i6
i7
i8
i9
i10
i11
i12
mtRNA (%)
3.3
3.1
3.6
1.7
3.9
4.1
1.8
2.5
2.8
5.5
4.1
2.7
4.8
rRNA (%)
0.6
1.2
0.7
1.1
0.4
0.4
0.3
0.3
0.7
1.2
0.5
0.1
0.6
Uniquely mapped reads (%)
69
68
68
70
68
71
71
72
68
69
69
74
69
Total mapped reads (%)
97
96
98
97
97
98
98
98
96
97
96
98
98
Number of reads (M)
21.6
2.3
5
1.3
2.2
2
1.9
0.8
1.3
0.6
0.2
1.5
1.6
表1.K562単一細胞由来のライブラリープールのマッピング率
K562細胞は1細胞/μlとなるようにPBSで希釈し、12個の単一細胞を単離、検定、溶解後、cDNA合成を行った。各ライブラリーをプールした後、イルミナ社 MiSeqで解析した。プール化ライブラリーからのデータを、read 2のin-lineバーコードをもとに各ライブラリーに分画した。全てのライブラリーは、human genome (hg19)上にSTAR v.2.3.0.1を使用してマップした。96%以上の高率でゲノムへマップされ、rRNAやミトコンドリアへのマップは低率であった。

内容

  • SeqAmp DNA Polymerase
      SeqAmp DNA Polymerase
      SeqAmp PCR Buffer
  • Box 1
      Control Total RNA
  • Box 2
    SMART-Seq v4 Oligonucleotide (48 μM)
    PCR Primer II A (12 μM)
    5X Ultra Low First-Strand Buffer
    SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
    Nuclease-Free Water
    RNase Inhibitor (40 U/μl)
    10X Lysis Buffer
    Elution Buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5)
    Oligo dT In-Line 1 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 2 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 3 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 4 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 5 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 6 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 7 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 8 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 9 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 10 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 11 Primer (12 μM)
    Oligo dT In-Line 12 Primer (12 μM)
  • Box 3
    Reverse PCR Primer HT Index 1 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 2 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 3 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 4 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 5 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 6 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 7 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 8 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 9 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 10 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 11 (10 μM)
    Reverse PCR Primer HT Index 12 (10 μM)
    Tn Forward PCR Primer HT Index 1 (10 μM)
    Tn Forward PCR Primer HT Index 2 (10 μM)
    Tn Forward PCR Primer HT Index 3 (10 μM)
    Tn Forward PCR Primer HT Index 4 (10 μM)
    Tn Forward PCR Primer HT Index 5 (10 μM)
    Tn Forward PCR Primer HT Index 6 (10 μM)
    Tn Forward PCR Primer HT Index 7 (10 μM)
    Tn Forward PCR Primer HT Index 8 (10 μM)

保存

Control Total RNA:-70℃
その他のコンポーネント:-20℃
(10X Lysis Buffer: 融解後は4℃保存、Elution Buffer:融解後は室温保存)

本製品以外に必要な試薬等

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

PCR増幅およびバリデーション:
・First-Strand cDNA 合成専用のPCRサーマルサイクラー
・Double-Strand cDNA 増幅専用のPCRサーマルサイクラー
・High Sensitivity DNA Kit(Agilent社 Code 5067-4626)
・Nuclease-free thin-wall PCR tube(0.2 ml;USA Scientific社 Code 1402-4700)
・Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube(USA Scientific社 Code 1415-2600)またはLoBind tube(Eppendorf社 Code 022431021)

SPRI Bead精製:
・Agencourt AMPure PCR Purification Kit(5 ml Beckman Coulter社 Code A63880 ; 60 ml Beckman Coulter社 Code A63881)-増幅cDNAの精製に使用する
・1.5 ml チューブ用Magnetic stand
・8-tube strip用Magnetic stand(Magnetic Separator - PCR Strip、製品コード 635011)
・96-well plate用Magnetic stand (Thermo Fisher社 Cat AM10027)
・100% Ethanol

シーケンスライブラリー作製:
・Nextera XT DNA Sample Prep Kit(Illumina社 Code FC-131-1024, FC-131-1096)

その他
・シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μl、200 μl、1 ml
・8連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
・フィルターピペットチップ: 2 μl、20 μl、200 μl、1 ml
・1.5 ml tube用minicentrifuge
・0.2 ml tubeまたはstrip用minicentrifuge

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注意事項
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