糖組成分析の操作手順を下に示す。これは従来の方法と異なり、酸加水分解、N-アセチル化、PA化のすべてのステップで揮発性の試薬を用いるので、過剰の試薬を減圧留去するだけで除くことができる。このことにより1本の試験管内ですべての反応を行うone-tube reactionが可能となった。またHPLC分析に陰イオン交換カラムを、溶出にホウ酸緩衝液を用いているので分離能が非常によくなり、PA化単糖のピークを残存の試薬や試料のタンパク質、脂質部分由来のピークに影響されることなく分析できる。このことにより蛍光標識後、試料を精製することなく直接HPLCのカラムで分析できるようになった^4）。
■操作手順
試料（100 pmol～10 nmol）
　｜←4 Mトリフルオロ酢酸を40 μl添加、100℃にて3時間加熱
　｜←内部標準（リボース、100 pmol～10 nmol）を添加
　├　濃縮乾固
　｜←ピリジン/メタノール/水（15：30：10）を50μl、無水酢酸を2 μl添加
　｜　室温にて30分間放置
　├　濃縮乾固
　↓
糖混合物
　｜
　├　PA化
　｜　（PA化の操作は、PALSTATION専用の単糖分析用試薬キットの
　｜　　プロトコールに従い行う）
　↓
PA化糖混合物
　｜
　｜←水を100 μl～1 ml添加
　↓
HPLC分析（1/10～1/100量をカラムに注入）

図2　複合糖質の糖組成分析

■操作手順
1. 複合糖質に含まれる主な10種類の糖をそれぞれ1 nmol用意し、混合したものをプロトコールに従いPA化する。
2. PA化単糖の混合物を水に溶解する。
3. 1/100量にあたる10 pmol相当をPALPAK Type Aにて分析する。

■結果
PA-N-アセチルガラクトサミン、PA-2-デオキシリボース、PA-ラムノース、PA-キシロース、PA-N-アセチルグルコサミン、PA-リボース、PA-グルコース、PA-マンノース、PA-フコース、PA-ガラクトースの溶出順序で、よい分離パターンが得られた。

Column：	PALPAK Type A（4.6 mmΦ×150 mm）
Solvent：	CH3CN：0.7 M H3BO3-KOH（pH9.0）="1"：9
Flow rate：	0.3 ml/min
Column Temp：	65℃

図3 PA化単糖10種混合物のHPLC分析

■操作手順
1. 各糖の含量を10 pmolから1 nmolに調製した混合物を、それぞれプロトコールに従い酸加水分解、N-アセチル化、PA化を行う。
2. PALPAK Type Aにて分析する。

■結果

図4 PA化単糖の検量線

縦軸にPA化の単糖のピークの高さ、横軸に試料の糖の量をとり検量線を作成する（図4）。
このようにN-アセチルガラクトサミン、N-アセチルグルコサミン、フコース、ガラクトース、マンノースともによい直線性を示し、定量性を確認することができた（縦軸にPA化単糖のピークの面積をとった検量線も同様の結果を示すことを確認している）。

α₁-酸性糖タンパク質は約44,000の分子量を持ち、約44%のN-アセチルラクトサミン型糖鎖を含むことが知られている。このことを以下の実験により確認する。
■操作手順
1. α₁-酸性糖タンパク質100 pmolを用い、プロトコールに従って酸加水分解、N-アセチル化、PA化を行う。
2. 1/10量にあたる10 pmol相当をPALPAK Type Aにて分析する。

■結果
スタンダードのPA化単糖とのピークの高さの比較によりN-アセチルグルコサミン、マンノース、フコース、ガラクトースを22：12：2：12の割合で含むことが確認できた。

Column：	PALPAK Type A（4.6 mmΦ×150 mm）
Solvent：	CH3CN：0.7 M H3BO3-KOH（pH9.0）="1"：9
Flow rate：	0.3 ml/min
Column Temp：	65℃

図5 α₁-酸性糖タンパク質のHPLC分析

■操作手順
1. ガングリオ系列の糖脂質GM2を100 pmolとり、プロトコールに従ってPA化を行う。
2. 1/10量にあたる10 pmol相当をPALPAK Type Aにて分析する。
■結果
スタンダードのPA化単糖とのピークの高さの比較によりN-アセチルガラクトサミン、グルコース、ガラクトースを1.0：1.0：1.0の割合で含むことが確認できた。

Column：	PALPAK Type A（4.6 mmΦ×150 mm）
Solvent：	CH3CN：0.7 M H3BO3-KOH（pH9.0）="1"：9
Flow rate：	0.3 ml/min
Column Temp：	65℃

図6 糖脂質GM2のHPLC分析