Cassette Primersの塩基配列と選定の目安

1.既知領域からの選定

増幅を行いたい未知領域に対して、その領域を増幅させる方向に作製する。
S1、S2の位置関係は、S2はS1の内側に位置し、その2つのプライマー間の隔たりに特に制限はない。

そのデザイン上の条件としては
●鎖長は20~35塩基(長鎖DNA断片の増幅が期待される場合は30~35塩基)が望ましい。
●GC含量は50%程度とし、部分的にGCあるいはATに片寄るのを避ける。特にプライマーの3'側がATリッチにならないようにする。
●プライマー自身にヘアピン等の著しい2次構造がないようにする。
●両Specific Primer(S1、S2)は、Cassette Primer(C1、C2)との組合せで用いるため、プライマーダイマーを形成しないように、特に3'側の3、4塩基の部分が相手側の配列と相補的にならないようにする。
等が考えられる。

2.タンパク質のアミノ酸配列を基にする選定
●得られたアミノ酸配列を基にプライマーを選定する場合、まずアミノ酸配列よりそれをコードする塩基配列に変換する。なるべくdegeneracyの少ない領域よりプライマーを選択するようにするが、degeneracyの少ない短いプライマーよりはdegeneracyが多少多くても長いプライマーの方がよい結果が得られることが多い。
●degeneracyが多いプライマーはそのままを用いるしかないが、どうしてもdegeneracyを少なくしたい場合は、codon usageを考えて作製すること等が考えられる。
●3'末端はmixにはならないようにする。
●mixed primerを用いるとアニーリング温度を下げることが必要となり、その結果非特異的な増幅が起こりやすくなる。配列の情報に余裕がある場合には、さらに内側にプローブを作製することによって目的の増幅断片を同定することが可能となる。

Cassette、Cassette Primerの塩基配列

Sau3A I Cassette
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGA 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TAG OH 5’
EcoR I Cassette
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG AG 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TCTTA A OH 5’
Hind III Cassette
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG A  3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TTCGA OH 5’
Pst I Cassette
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG ACTGC A  3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TG OH 5’
Sal I Cassette
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG AG 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TCAGC T OH 5’
Xba I Cassette
5’HO GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA CTATA GGGAG AT 3’
3’ CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC TAGAT C OH 5’
Cassette Primer C1   d(GTACA TATTG TCGTT AGAAC GCGTA ATACG ACTCA)
Cassette Primer C2   d(CGTTA GAACG CGTAA TACGA CTCAC TATAG GGAGA)

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