siRNA発現用組換えレトロウイルス作製の概要

A: siRNA発現レトロウイルベクタープラスミドの作製

ベクター図
pSINsi DNAをBamH IとCla Iで消化し、スタッファー(920 bp)を除く。


二本鎖合成オリゴDNAの挿入
ヘアピン型RNA発現のための二本鎖合成オリゴDNAをBamH I ‐ Cla I部位にライゲーションする。


piSINsi siRNA発現ベクタープラスミド

インサートの挿入はBln IとBamH Iで消化して、約340 bpの断片で確認する。


B: siRNA発現レトロウイルスベクターの作製(Retrovirus Packaging Kitを用いる方法)

293細胞または293T細胞にsiRNA発現レトロウイルスベクタープラスミドとRetrovirus Packaging Kit添付のレトロウイルスgag-pol発現ベクター、レトロウイルスenv発現ベクターをリン酸カルシウム法でco-transfectionする。


培地交換を行い、トランスフェクションから48時間後に上清を0.45 μmフィルターでろ過回収する。


回収したウイルス液は小分けして-80℃で保存し、凍結融解の繰り返しは避ける。

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