シグナル伝達経路プロファイリングシステム

Pathway Profiling Systemは、シグナル伝達経路の活性化をin vivoで評価する手段を提供する。本システムはレポーター遺伝子の上流にそれぞれ異なるシスエレメントを組み込んだベクター（図1）をセットにしたものである。ベクターのいくつかは個別にも販売している。1回のトランスフェクション実験で、外部から与えた刺激、薬剤または遺伝子産物によって影響を受ける転写因子のプロファイルを取得することが可能である。
レポーターベクター（Pathway Profiling Vector）にはルシフェラーゼまたはSEAP（分泌型アルカリホスファターゼ）がレポーターとして組込まれている。ルシフェラーゼ活性は、細胞ライセートを用いた通常のアッセイ法で測定可能である。SEAPは単に培養上清をサンプリングするだけで測定を行える。ClontechではSEAP活性の測定用のGreat EscAPe SEAP Detection Kitを用意している。
Pathway Profiling SEAPおよびPathway Profiling Luciferase Systemは広範なシグナル分析に使用できる（表1）。

図1. Pathway Profiling Vectors
ベクターには2種類のプロモーター（チミジンキナーゼ・プロモーター（TAL）由来のTATA様領域全体と、そのTATAボックス（TA）のみ）のどちらか一方が組み込まれている。

表1. Pathway Profiling Systems Applications
※各システムには適切なネガティブコントロールベクターを添付しています。これらのベクターはエンハンサー配列のクローニングにも使用できます。


図2. Luciferase System 2が外部刺激に対して示す特異的な応答
HEK 293細胞にSystem 2 Vectorをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞に10 ng/mlのPMAまたは10 ng/mgのPMAとさらに1 μMのイオノマイシン（ionomycin）を加え、6時間処理した。処理後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。PMA（PKC活性化因子）とイオノマイシン（細胞内カルシウム濃度の上昇を引起す）の処理により、pNFAT-TA-Lucでは50倍、pAP-1-TA-Lucでは30倍、pNFκB-TA-Lucでは3倍の誘導が生じている。pTA-Luc Vectorはエンハンサーエレメントを含まないネガティブコントロールである。
RLU＝相対発光強度

Pathway Profiling SEAP System
（製品コード 631910）
・20 μg pTAL-SEAP Vector (0.5 μg/μl; negative control)
・20 μg pSEAP2-Control Vector (0.5 μg/μl; positive control)
・20 μg pAP1-SEAP Vector (0.5 μg/μl)
・20 μg pSRE-SEAP Vector (0.5 μg/μl)
・20 μg pGRE-SEAP Vector (0.5 μg/μl)
・20 μg pNFκB-SEAP Vector (0.5 μg/μl)
・20 μg pNFAT-SEAP Vector (0.5 μg/μl)
・20 μg pCRE-SEAP Vector (0.5 μg/μl)
・20 μg pMyc-SEAP Vector (0.5 μg/μl)
・20 μg pHSE-SEAP Vector (0.5 μg/μl)
・1 ml 2 M Calcium Solution
・7 ml 2× HEPES-Buffered Saline (HBS)
・7 ml Sterile H₂O

Kinase Expression Vector Set
（製品コード 631927）
・20 μg pCMV-MEK1 Vector
・20 μg pCMV-MEKK1 Vector
・20 μg pCMV-PKA Vector

Transfection Reagents, Vectors：－20℃
その他のコンポーネント：4℃