Illumina社NGSプラットフォームのためのcDNA調製キット

  • イルミナ社HiSeqシステム、GAIIxシステムのためのcDNA調製キット
  • わずか10 pgのtotal RNAから高品質のcDNA調製
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略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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資料
CLN 634936 Z4936N SMARTer® Ultra® Low RNA Kit for Illumina® Sequencing
100回 ¥1,320,000
説明書・データシート・ベクター情報

日本語取扱説明書に関する重要なお知らせ

製品説明

SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingは、イルミナ社の次世代シーケンス技術(next-generation sequencing;NGS)を用いた遺伝子発現解析に適合するよう設計されたcDNA調製キットである。わずか10 pgのtotal RNAから、HiSeqシステム、HiScanSQシステム、またはGenome Analyzer IIxシステムに利用可能なcDNAを調製することができる。調製したcDNAは、イルミナ社独自のSequencing By Synthesis (SBS)法で使用するライブラリー調製プロトコールに直接用いることができる。

RNA-Seq(RNA Sequencing)解析は、それまでの遺伝子発現解析に比べるとはるかに少ないRNA量で解析を行うことができるが、非常に少量のサンプル量の場合には解析が難しい場合があった。しかし、本製品とイルミナ社のNGSシステムを用いることで、生検材料や単一細胞レベルなどの極めて微量なサンプルからも、高感度で再現性のある遺伝子発現解析を行うことができる。

SMART technology

SMART(Switching Mechanism At 5’End of RNA Template)技術は、シングルステップで完全長のcDNAを合成することができるClontech独自の技術である。非増幅時と同様の存在比を保ったまま、完全長cDNAを増幅させることができる。SMARTer Ultra Low RNA Kitは、SMART (er)キットのプロトコールをイルミナ社のNGSシステムに適合するために最適化されており、NGS解析のライブラリー調製のために十分なcDNA量を微量のRNAから調製することができる(図1、図2)。



図1. さまざまなRNA量からcDNAを合成した時の電気泳動
さまざまな量(1 ng(赤)、0.1 ng (紺)、0.05 ng(緑)、0.01 ng(水色)、no template control(NTC;ピンク))のUniversal Human Reference Total RNA(UHR)とHuman Brain Reference RNAからSMART cDNA合成を行い、合成されたcDNAの純度と合成量をAgilent 2100 Bioanalyzerを用いて解析した。合成cDNAは0.4~9 kbにわたって分布しており、最も高いピークは2 kb前後に確認された。ネガティブコントロールでは増幅は確認されなかった。PCRサイクル数を調整することにより、さまざまなRNA量から同程度のcDNAを調製することができる


図2. シーケンス解析を行うまでのサンプル調製の流れ

極微量RNAからのNGS解析

SMARTer Ultra Low RNA Kitは、サンプルRNA量に対して広いダイナミックレンジと高い再現性を示す。イルミナ社のNGS装置を用いた場合、単一細胞レベルの極めて微量のRNAから信頼性の高い遺伝子発現解析を行うことができる。Mouse brain total RNA、10 ng、1 ng、0.1 ng、0.05 ng、0.01 ngを用いてライブラリーを作製し、イルミナ社GAIIxシステムを用いてシーケンス解析を行いマウスゲノム上にマッピングを行った(各サンプルについて1 laneを使用。~20 million reads/lane)。その結果、わずか10 pgのRNAを用いた場合でもシーケンスデータの90%以上をゲノム上にマッピングすることができ、転写領域カバー率はより多くのRNA量を用いた場合と同等であった(表1、図3)。



表1. 微量RNAからのシーケンス解析結果




図3. インプットRNA量と転写産物領域の比較
SMARTer Ultra Low RNA Kitを用いて1 ngから0.01 ngのmouse brain total RNAからそれぞれcDNAを調製し、GAIIxシステムによりシーケンス解析を行った時のライブラリーの転写領域の平均リード数の比較データ。X軸は、各遺伝子長を100%として表し、数値0は遺伝子転写産物の5’端を、数値100は3’端を示めしている。Y軸は、脳組織で中程度から高発現の600遺伝子について、その平均転写産物のカバー率を示す。この結果から、本キットにより作製されたcDNAライブラリーでは、開始のRNA量に関らず、遺伝子のほぼ全領域をカバーしており、5’端や3’端でのcDNA合成のバイアスは見られない。

極微量RNAからの遺伝子発現データはqPCRのデータと強い相関性を示す

MicroArray Quality Control (MAQC)プロジェクトからのUniversal Human Reference Total RNA(UHR)とHuman Brain Reference RNAを用いて、SMARTer Ultra Low RNA Kit(total RNA量 1ng)から得られたシーケンスデータの発現比較と定量PCR(qPCR)による発現比較の結果についてスキャッタープロット解析を行った。
~700種の遺伝子の発現差では相関係数0.94を示し、本製品により調製されたcDNAのシーケンス結果は他の遺伝子発現技術の結果とよく一致した(図4)。



図4. 極微量RNAを用いたcDNAシーケンス解析結果と定量PCR結果の相関性

内容

・SMARTer II A Oligonucleotide
・Control Total RNA
・3’SMART CDS Primer II A
・IS PCR Primer
・5×First-Strand Buffer (RNase-Free)
・dNTP Mix
・Dithiothreitol
・SMARTScribe Reverse Transcriptase
・Nuclease-Free Water
・RNase Inhibitor
・Dilution Buffer
・Purification Buffer

保存

Control Total RNA、SMARTer II A Oligo:-70℃
Dilution Buffer:4℃
その他のコンポーネント:-20℃

用途

イルミナ社のNGSシステムを用いたRNA-SeqのためのcDNAの調製

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