環境中の細菌の群集構造解析用ライブラリー作製

Bacterial 16S rDNA Clone Library Construction Kit

メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR R160 R160 Bacterial 16S rDNA Clone Library Construction Kit
20回 ¥57,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

Bacterial 16S rDNA Clone Library Construction Kitは、環境中のバクテリアの群集構造を解析する手法の1つである16S rDNA Clone Library法を効率良く行うために開発された、タカラバイオ独自のシステムである。環境中のバクテリア由来のゲノムDNAから16S rDNAの特定領域をPCRで増幅し、高効率にクローニングして、クローンライブラリーを構築できる。
本システムでは、PCR酵素にクルードサンプルからも良好なPCRが可能なTks Gflex DNA Polymeraseを使用しており、ベクターには陽性クローンの選別が不要なPositive SelectionタイプのpBackZero-alphaを使用している。そのため、一般的な手法であるPCR産物のTAクローニングによる16S rDNA Clone Library構築に比べ、高効率にライブラリーを作製することができる。
本製品により、5×105 cfu/μg以上のクローニング効率(注)で、blue/white選択の必要もなく、得られたクローンの99%以上が陽性クローンとなる。さらに平滑末端クローニングでありながら、得られたクローンの99%以上が同一方向にクローニングされるため、ベクター上の配列に対するプライマーによる同一方向からのシーケンスが可能になり、PCRプライマーの直後の配列も確実に解析できる。
(注)コンピテントセルの効率など実験条件により低下する場合がある。

内容

(20回分)
1.Tks Gflex DNA Polymerase*1(1.25 units/μl)40 μl
2.2 × Gflex PCR Buffer(Mg2+, dNTP plus)*11,000 μl
3.pBackZero-alpha linear vector*2(50 ng/μl)20 μl
4.16S-FA / 16S-R3 PCR primer Mix*3(各10 pmol/μl)40 μl
5.DNA Ligation Kit <Mighty Mix>*4150 μl
6.sequencing primer BlaM1(10 pmol/μl)30 μl
7.sequencing primer BlaRV(10 pmol/μl)30 μl
8.DNA free H2O1 ml×2本
9.Positive Control DNA*5(1 ng/μl)10 μl
*1Tks Gflex DNA Polymerase(製品コード R060A)に含まれる酵素およびバッファーと同じものです。PCR反応40回分です。サンプル増幅20反応分および各10回のPositive Control反応、Negative Control反応を行うことができます。
*2クローニングサイトで平滑末端に切断された直鎖状のベクターです。
*316S-FA/16S-R3 PCR primer Mixは、バクテリア16S rRNAを増幅するためのユニバーサルプライマーである27fおよび1492rの5’末端に特別の配列を付加したものである。配列を付加していないプライマーは本キットでは使用できない。
*4DNA Ligation Kit <Mighty Mix>(製品コード 6023)と同じものです。
*5大腸菌JM109のgenome DNAの両端に16S 27f/1492r primer配列を付加したものをクローニングしたplasmid DNAです。16S-FA/16S-R3 PCR primer Mixにより、1,068 bpが増幅するように設計されています。10回のPositive Control反応を行うことができます。

[各プライマーの配列]
・16S-FA PCR primer
   5'-TTTTAAAGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3'
・16S-R3 PCR primer
   5'-TTAATACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3'
・sequencing primer BlaM1
   5'-AAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATC-3'
・sequencing primer BlaRV
   5'-ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCA-3'

保存

-20℃

キット以外に必要な試薬

【pBackZero-alphaベクターマップ】
pBackZero-alphaベクターマップ

【pBackZero-alphaシーケンスデータ】
pBackZero-alpha DNAのシーケンスデータ(Fastaファイル)

本製品を用いたクローニングシステムの原理

本製品を用いたクローニングシステムの原理

pBackZero-alpha vectorは、Tks Gflex DNA Polymeraseなどのα型PCR酵素によって増幅された平滑末端のPCR産物を効率よくクローニングするためのベクターであり、ベクター上のアンピシリン耐性遺伝子であるβ-lactamase(bla)遺伝子の3’末端のTGG(Trpをコード)を欠失させる独自の改変を行ってクローニングサイトにしている。β-lactamaseは、C末端のTrpが欠失すると活性が消失するため、本ベクターそのままではアンピシリン耐性とならない。
β-lactamaseの活性は、C末端にTrp(TGG)+Stopコドンという配列を付加することで復活するが、Trp以外の芳香族アミノ酸でも活性は復活する。本製品のPCRでは5’末端に芳香族アミノ酸であるPhe(TTT)およびStopコドン(TAA)の6塩基を付加したプライマー(16S-FA PCR primer)を使用する。このプライマーで増幅したPCR産物を本ベクターにクローニングすると、β-lactamaseの活性が復活し、得られたクローンはアンピシリン耐性となる。
そのため、クローンの選別にはblue/white選択の必要はなく、LB-Amp plate上に生えたクローンの99%以上が陽性クローンとなる。本キットに付属するPositive Control DNAから、本キットを用いて増幅したPCR産物をクローニングした場合、1回の反応で5×105 cfu/μgの16S rDNA Clone Libraryが作製可能である。

さらに本キットでは、平滑末端クローニングでありながら、方向性を持ったクローニングが可能である。PCRプライマーの片方(16S-FA)のみの5’末端にTTTTAAの6塩基を付加しているので、bla遺伝子と同じ方向に16S rDNAが挿入されたクローンだけがアンピシリン耐性となり、逆方向に挿入されたクローンおよびインサートを持たないクローンはアンピシリン感受性となる。そのため、LB-Amp plate上に得られたクローンの99%以上がbla遺伝子と同じ方向に16S rDNAが挿入されたクローンになる。これは、単離したクローンのシーケンスを行う際に非常に有利である。ベクターの上流側のsequencing primer BlaM1を用いてシーケンスした場合、16S RNAの27f側からの配列が確実に得られ、PCRプライマーの直後のシーケンスも読むことができる。

シーケンス解析

本システムで得られたクローンライブラリーのシーケンス解析を行う場合、一般的な16S rDNAのユニバーサルプライマーが使用できる。また、本システムで得られたクローンライブラリーは、99%以上がbla遺伝子と同一の方向性を持ってクローニングされているので、キット付属のsequencing primer BlaM1を使用して、16S rDNAの27f側を、sequencing primer BlaRVを使用して、16S rDNAの1492r側を解析することが可能である。

シーケンス解析には、タカラバイオ受託サービスのシーケンス解析のご利用をお勧めします。

塩基配列情報の解析

得られた塩基配列情報をデータベース上の配列と相同性検索を行い、その結果より細菌の種類を類推する。
解析システムとしてテクノスルガ・ラボ微生物同定システム(解析ソフトウェア アドバンスト 製品コード 14107142 ほか)を推奨する。このシステムを用いると、簡単な操作で菌種の絞り込みを行うことができる。

(参考情報)
  • BLAST検索は、BLASTアルゴリズムを実装したプログラムをダウンロードして利用することができる。
     NCBI BLAST:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
  • NCBIやDDBJのウェブ上でも使用することができる。
     NCBI: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
     DDBJ: http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html
  • DNASIS Taxon V3.5(製品コード SK271)を使用すると、類推に要する時間と手間を大幅に軽減することが可能である。

  遺伝子検出・検査 関連試薬の選択フローをご利用ください

分野別の試薬選択フロー
手法別の試薬選択フロー

「検査(PCR/ELISA)」関連のお役立ち情報専用ページもご参照ください。

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注意事項
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