マウスIgG H鎖/L鎖の可変領域の完全長をシーケンス

SMARTer® Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit

  • マウスIgGのH鎖、L鎖(κ鎖、λ鎖)の完全長可変領域V(D)Jシーケンスのためのライブラリー作製
  • 同一サンプルから異なる鎖(H鎖、κ鎖、λ鎖)を高感度に検出
  • インプット:脾臓、リンパ節、PBMC(末梢血単核球)、ハイブリドーマから精製したtotal RNA 10 ng~3 μgまたは精製済みB細胞1,000~10,000個
  • 高い特異性と高感度でクロノタイプを検出
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別)
キャンペーン価格
特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 634422 Z4422N SMARTer® Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
  • RNAシーケンス解析
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
12回 ¥180,000
¥144,000
2017/11/27~
2018/02/28

説明書・データシート・ベクター情報
CLN 634423 Z4423N SMARTer® Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
48回 ¥580,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 634424 Z4424N SMARTer® Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
96回 ¥920,000
説明書・データシート・ベクター情報

※色文字での表示は、キャンペーン価格およびそのキャンペーン期間です。

製品説明

B細胞は免疫応答における重要な役割を持ち、細胞表面には病原体の特異的分子を認識するB細胞受容体(BCRs)を発現する。BCRプロファイリング(特異的なHおよびL遺伝子セグメントの多様性やクロノタイプを検出)により、健常な個体の免疫応答だけではなく、様々な疾患に対応する免疫応答の解明にもつながる。免疫システムによって発現が異なるクロノタイプを正確に同定することで、B細胞レパトア解析が可能になる。

SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kitは、5’RACE法とNGSテクノロジーを組み合わせることにより、BCRプロファイリングの高感度で正確なアプローチを提供する。複数のBCR遺伝子プライマーを用いて増幅するマルチプレックスPCRによるシステムは、プライマーに起因する感度、特異性およびバイアスに関して課題が見られることが判明しており、その結果、クロノタイプの同定が難しくなることが予想されるが、本キットで用いる5’RACE法では、BCRのH鎖、L鎖の定常領域にアニーリングする単一プライマーですべての可変領域を増幅するため、バイアスの少ない解析が可能になる。

本キットでは、BCR mRNAのV(D)J可変領域全体を含んだライブラリーを作製することで、高感度で再現性の高いB細胞レパトア解析を実現する。本キットで作製されたライブラリーを用いてH鎖、κ鎖、λ鎖の3種類のシーケンスを行うことにより、クロノタイプの正確な同定を行うことができる。
図1. BCRの再構成
図1. BCRの再構成
前駆細胞は生殖系列でV, DおよびJセグメントの組換えを起こし、2つのHeavy chain(H鎖)を生じる。一方、VおよびJセグメントの組換えにより2つのLight chain(L鎖)を生じる。
V、DおよびJセグメントの接合によるランダムな塩基の追加または欠失によりさらに多様性が生じる。さらにB細胞が免疫応答により活性化され、さらなる点変異を生じる体細胞突然変異(SHM)を生じる。
図2.
図2.
図2.
Panel A. SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kitのワークフロー
Panel B. BCR IgGの可変領域のcDNA増幅のための2段階PCR
1st PCRは 1st strand cDNAをテンプレートにして、イルミナの Read Primer 2配列と相補的なフォワードプライマー(BCR Primer 1V)とBCRの H鎖またはL鎖の定常領域(非可変領域)に相補的なリバースプライマー(mBCR Primers 1H, 1K, or 1L)で行う。
各鎖は別々の反応で増幅する。Read Primer 2配列と定常領域から増幅することにより、1st PCRによりBCRのH鎖またはL鎖のcDNAの可変領域全体と大部分の定常領域を特異的に増幅する。
2nd PCRは 1st PCRの産物をテンプレートにして、semi-nested プライマー(mBCR Primers 2H, 2K, or 2L)を使用してBCRのH鎖またはL鎖のcDNAの可変領域全体と定常領域の一部を増幅する。1st PCR同様、サブユニットの鎖は別々の反応により増幅する。
図3. 各鎖の異なるライブラリープール方法によるアラインメント率と on-target率(%)
図3. 各鎖の異なるライブラリープール方法によるアラインメント率と on-target率(%)
BCRのH鎖とL鎖を含むハイブリドーマ(10E8、HB-8117、TIB-127)からtotal RNAを抽出後、10 ngのtotal RNAとSMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kitを用いてライブラリーを作製した。
H鎖とκ鎖のみのライブラリーをプールしてシーケンスした場合(表中でHKと記載)、IG reference配列(MiXCRソフトウエア Version1.8)に高いアラインメント率が得られた。
H鎖、κ鎖およびλ鎖のライブラリーをプールした場合(表中でHKLと記載)、アラインメント率は低くなったが、多くのH鎖とκ鎖の配列(トップの2 clone)は同一で、それぞれの鎖の割合も同じであった。
また、抗体のアフィニティを規定するCDR3アミノ酸配列もそれぞれのクロノタイプで示された。
図4. 5種類のIgGのサブクラスの増幅
図4. 5種類のIgGのサブクラスの増幅
図4. 5種類のIgGのサブクラスの増幅
異なるIgGサブタイプの自家調製ハイブリドーマ(10E8)と2種類のATCCのハイブリドーマ(HB-8117、TIB-127)からtotal RNAを抽出した。10 ng total RNAとSMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kitを用いてライブラリーを作製した。
Panel A:バイオアナライザーの結果より、各ハイブリドーマよりH鎖またはL鎖(κ、λ)の特異的な増幅が確認できた。それぞれのサンプルにおいて、700~900 bpの間でピークが得られ、ピークのパターンから、κ鎖がこれらのハイブリドーマで発現していることを示している。一方、λ鎖のライブラリーは比較的ブロードで小さなサイズのパターンになった。
Panel B:MiXCRソフトウェア(version 1.8)でIG reference配列マッピングした結果より、トップの2クローンのV、DおよびJ遺伝子が同定された。但し、IgGのサブクラスはサンプルによって同定できない場合がある。

内容

Package 1:
Control Total RNA (1 μg/μl)
BCR Oligonucleotide (24 μM)
Package 2:
BCR dT Primer (12 μM)
5X Ultra Low First-Strand Buffer
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
Nuclease-Free Water
RNase Inhibitor (40 U/μl)
Lysis Buffer
Elution Buffer (10 mM)
mBCR Primer 1H (12 μM)
mBCR Primer 1K (12 μM)
mBCR Primer 1L (12 μM)
BCR Primer 1V (12 μM)
PrimeSTAR GXL SP DNA Polymerase (1.25 U/μl)
5X PrimeSTAR GXL SP Buffer
dNTP Mixture (2.5 mM each)
Mouse BCR IgG H/K/L Indexing Primer Set HT for Illumina:
12回用(製品コード 634422)
 mBCR Primer 2H D501 (2H01; 12.5 μM)
 mBCR Primer 2K D501 (2K01; 12.5 μM)
 mBCR Primer 2L D501 (2L01; 12.5 μM)
 BCR Primer 2V D701-D712 (2V01-2V02; 12.5 μM)
48回用(製品コード 634423)
 mBCR Primer 2H D501 (2H01; 12.5 μM)
 mBCR Primer 2K D501-D504 (2K01-2K04; 12.5 μM)
 mBCR Primer 2L D501-D504 (2L01-2L04; 12.5 μM)
 BCR Primer 2V D701-D712 (2V01-2V02; 12.5 μM) 12.5 μM)
96回用(製品コード 634424)
 mBCR Primer 2H D501 (2H01; 12.5 μM)
 mBCR Primer 2K D501-D508 (2K01-2K08; 12.5 μM)
 mBCR Primer 2L D501–D508 (2L01-2L08; 12.5 μM)
 BCR Primer 2V D701-D712 (2V01-2V02; 12.5 μM) 12.5 μM)

輸送

-70℃

保存

Package 1:-70℃
Package 2:-20℃
10X Lysis Buffer、Nuclease-Free Water:-20℃保存。一度融解した後は4℃保存
Elution Buffer: -20℃保存。一度融解した後は室温保存
Mouse BCR IgG H/K/L Indexing Primer Set HT for Illumina:-20℃

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
  • シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
  • フィルターピペットチップ: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 微量遠心機 (1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用)
PCR増幅およびバリデーション
  • 1st strand cDNA合成用のPCRサーマルサイクラー
  • PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
  • High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit(Advanced Analytical社 Code. DNF-474)
  • Agilent 2100 Bioanalyzer: DNA 1000 Kit(Agilent社 Code. 5067-1504)
  • Nuclease-free thin-wall PCR tube(0.2 ml;USA Scientific社 Code. 1402-4700)
  • Nuclease-free-low adhesion1.5 ml tubes(USA Scientific社 Code. 1415-2600) または、LoBond tubes(Eppendorf社 Code. 022431021)
SPRI Bead精製
  • Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit(Beckman Coulter社; 5 ml Code. A63880、60 ml Code. A63881)
  • 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device(SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip:製品コード 635011)など
  • 100% Ethanol

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注意事項
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