Pfu NucS CycleavePCR法の実験例

1.ゲノムDNAでのスパイク試験

293FT細胞のゲノムに500、50、5 copiesのKRAS G12D変異遺伝子の配列断片をスパイクし、検出感度の評価を行った。
→ 293FT細胞ゲノム50,000コピー中に存在する5コピー変異遺伝子を検出した。0.01%の変異遺伝子を検出することが可能であることができる。

KRAS G12D spike
Background:5,000 copies 293FT genome DNA
Spike:500, 50, 5 copies
KRAS G12D spike
Background:50,000 copies 293FT genome DNA
Spike:500, 50, 5 copies
変異遺伝子
(FAM)
変異遺伝子
変異遺伝子
(FAM)
変異遺伝子
internal
control(Cy5)
0.1%の変異遺伝子を検出
変異遺伝子
internal
control(Cy5)
0.01%の変異遺伝子を検出
変異遺伝子

2.組織検体での検出

5種類のKRAS G12D 卵巣明細胞腺がん(OCCC検体)組織検体より精製されたゲノムDNA10 ngを鋳型に、Pfu NucS CycleavePCRとddPCR法でKRAS G12D変異遺伝子の検出(塩基GからAへの変異検出)を比較した。
Pfu NucS CycleavePCRでも変異検出された。

Pfu NucS_CycleavePCRddPCR
変異遺伝子
(FAM)
<i>Pfu</i> NucS_CycleavePCR変異遺伝子
internal
control(Cy5)
<i>Pfu</i> NucS_CycleavePCR正常遺伝子

本試験に使用した検体はすべてドナー様からのインフォームド・コンセントを取得しています。

3.cfDNAでのスパイク試験

5,000コピー相当の陰性cfDNAに0、15、150コピーのKRAS G12D変異遺伝子の配列断片をスパイクし、Pfu NucS CycleavePCR法とddPCR法でKRAS G12D変異遺伝子の検出(塩基GからAへの変異検出)を比較した。
→ cfDNAでの変異検出においてPfu NucS CycleavePCR法は、ddPCR法と同様の検出が可能であった。

KRAS G12D spike
Background: 5,000 copies cfDNA
Spike: 150, 15, 0 copies
ddPCR
変異遺伝子
(FAM)
変異遺伝子
変異遺伝子
internal
control(Cy5)
変異遺伝子
変異遺伝子

4.cfDNAでの検出



本試験に使用した検体はすべてドナー様からのインフォームド・コンセントを取得しております。

血漿3検体より精製したcfDNAを鋳型にPfu NucS CycleavePCR法とddPCR法でKRAS G12D変異遺伝子の検出(塩基GからAへの変異検出)を比較した。
→ cfDNAでの変異検出において、Pfu NucS CycleavePCR法では、ddPCR法と同様の検出を1 tubeのリアルタイムPCRで達成可能であった。

Pfu NucS CycleavePCR

Set4MT(FAM)IC(Cy5)
SampleCtCt
CCC14(2.5 ng)33.329.13
CCC21(7.5 ng)31.05
CCC27(2.5 ng)42.2930.71
<i>Pfu</i> NucS CycleavePCR
検量線より定量
 Copies 
SampleMTICMT%
CCC14(2.5 ng)1344,2393.16%
CCC21(7.5 ng)01,1150.00%
CCC27(2.5 ng)0.591,4120.04%

ddPCR

 Events
SampleMTWT+MT
CCC14(2.5 ng)1432,271
CCC21(2.5 ng)0317
CCC27(2.5 ng)0627

 Copies 
SampleMTWT+MTMT%
CCC14(2.5 ng)1973,1976.2%
CCC21(2.5 ng)04980.0%
CCC27(2.5 ng)09420.0%
塗りつぶしはKRAS G12D変異体であるCCC14、CCC27を検出

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