Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs.
Cheng, L. et al. J. Clin. Invest. (2017) 127, 269-279.
この研究は、HIV-1複製を抑制する多剤併用抗レトロウイルス療法（cART）中にIFN-Iシグナル伝達経路が持続的に亢進している患者では、IFN-α/β受容体（IFNAR）阻害は、免疫機能回復を早め、HIV-1リザーバを抑制する戦略として有望である可能性を示唆しています。ヒト化マウスの脾臓から分離したヒトCD8 T細胞からRNAを精製し、SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingを用いてcDNAを合成しました。
Genetic dissection of the Arabidopsis spaceflight transcriptome: Are some responses dispensable for the physiological adaptation of plants to spaceflight?
Paul, A. L. et al. PLoS One (2017) 12, e0180186.
宇宙飛行への生理的適応に対する遺伝子型の影響を、遺伝子発現パターンを指標として検討しています。SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingを用いて構築したcDNAライブラリーのRNA-seqトランスクリプトーム解析により、環境の影響の測定と、植物の遺伝子型操作によって宇宙飛行への反応のすべてまたは一部が抑制される可能性の評価に使用できる指標が得られました。この研究は、宇宙飛行に対する植物の反応の多くが非適応反応と考えられ、遺伝子発現反応の少なくとも大半が、遺伝子型操作によって、宇宙での明らかな成長低下を伴うことなく抑制できると結論付けています。
Nat1 promotes translation of specific proteins that induce differentiation of mouse embryonic stem cells.
Sugiyama, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2017) 114, 340-345.
著者らは、真核生物翻訳開始因子4GのC末側の2/3と相同性を示すNat1が、マウス胚性幹細胞の分化に必要なタンパク質の翻訳に関与することを明らかにしています。この研究で実施したqRT-PCR法によるシングルセル発現解析には、SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingを用いて増幅したcDNAを使用しています。
Extracellular Vesicles Originate from the Conceptus and Uterus During Early Pregnancy in Sheep.
Burns, G. W., Brooks, K. E. ＆ Spencer, T E. Biol. Reprod. (2016) 94, 56.
ヒツジ子宮内腔液の構成成分として細胞外小胞（EV）が発見され、受胎産物・母体間の相互作用の新たなメディエータである可能性が浮上しています。Day 14の受胎産物を培養し培地中に遊離したEVから、SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for SequencingおよびLow Input Library Prep Kitを用いてライブラリーを構築しました。これらの研究では、EVが受胎産物の栄養外胚葉と子宮上皮の両方から放出され、ヒツジの妊娠成立中にこれらの細胞間での細胞間連絡に関与しているという見解が裏付けられました。
Leukemia-associated activating mutation of Flt3 expands dendritic cells and alters T cell responses.
Lau, C. M. et al. J. Exp. Med. (2016) 213, 415-31.
サイトカインであるFLT3リガンド（FLT3L）の受容体であるFLT3の遺伝子内縦列重複（ITD）を検討しています。FLT3のITDは、急性骨髄性白血病で高頻度にみられる遺伝子変化です。FLT3-ITD変異はFLT3の恒常的活性化をもたらし、形質転換した前駆細胞の増殖を促進するのみならず、造血に多面的な作用を示します。脾細胞（CD8+古典的樹状細胞［cDC］、CD11b+ cDC、形質細胞様樹状細胞［pDC］）より分離した全RNAから、SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingを用いて、cDNAライブラリーを調製しました。著者らは、FLT3-ITD変異が樹状細胞の発生に直接影響を及ぼすとともに、間接的にT細胞のホメオスタシスを修飾しTreg細胞増殖を後押しすることを明らかにし、FLT3-ITDのこのような影響が免疫監視機構を抑制し、細胞外因性に白血病発生を促進するという仮説を提唱しました。
参考文献
シングルセル、超微量サンプルからのトランスクリプトーム解析（dTプライミング）
Single-Cell Resolution of Temporal Gene Expression during Heart Development.
DeLaughter, D. M. et al. Dev. Cell (2016) 39, 480-490.
細胞系列特異的な発生プログラムを時空間的に検討するため、胎生9.5日（原始心臓管）から生後21日（成熟心臓）までの7時点で分離した1,200個超のマウス細胞のシングルセルRNAシーケンス解析を実施しています。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて調製したcDNAライブラリーで得られたデータに基づき、ヒトおよびマウス多能性幹細胞由来の心筋細胞の明確な発生段階を定義したほか、ヘテロ接合変異マウスの心臓にみられた細胞系列特異的な成熟障害の特性を検討しました。
Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.
Loh, K. M. et al. Cell (2016) 166, 451-467.
多能性細胞から12のヒト中胚葉細胞系列（骨、筋肉、心臓など）が分岐していく過程での系列選択をマッピングしています。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いてシングルセルライブラリーを調製しました。著者らは、系列の分岐決定を制御し、細胞が望ましくない運命に向かう分化を理論上阻止するとともに、ほとんどの分岐点において、多能性幹細胞を80％～99％の純度でヒト中胚葉細胞系列へと速やかに誘導する外因性シグナルの条件を規定しました。この戦略により、各in vivoモデルに移植可能なヒト骨および心臓前駆細胞を作製できました。
Single-cell RNA-Seq resolves cellular complexity in sensory organs from the neonatal inner ear.
Burns, J. C., Kelly, M. C., Hoa, M., Morell, R. J. ＆ Kelley, M. W. Nat. Commun. (2015) 6, 8557.
SMARTer Ultra Low Input RNA Kit for the Fluidigm C1 Systemを用いて、新生児マウスの卵形嚢および蝸牛の感覚上皮から単離したシングルセル301個のトランスクリプトーム解析を実施しています。それぞれの組織由来の聴細胞と前庭細胞とを比較したところ、両種類の細胞は起源が共通であったものの、転写プロファイルが異なることが明らかになりました。この研究で得られたデータから、各種内耳細胞の発生過程についての重要な情報が得られました。
Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.
Camp, J. G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2015) 112, 15672-156777.
ヒト大脳オルガノイドおよび胎児の新皮質組織から採取した細胞の転写プロファイルを比較するため、SMARTer Ultra Low Input RNA Kit for the Fluidigm C1 Systemを用いて、シングルセルRNA-Seqを実施しています。オルガノイドの皮質様領域内の細胞は、構造化された大脳皮質を形成する際、胎児組織と極めて類似する遺伝的プログラムを使用することが確認されました。この結果は、大脳オルガノイドが、ヒト皮質発生の各種側面を研究する際に有用なモデルシステムであることを示唆しています。
Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells.
Reichel, J. et al. Blood (2015) 125, 1061-1072.
腫瘍微小環境を特徴付けると考えられる遺伝子変化（転写調節など）を検討するため、古典的ホジキンリンパ腫（cHL）患者から採取したサンプルの低インプット量でのエキソームシーケンス解析を最適化しました。エキソームデータからの変異は、フローソーティングにより分取したHodgkin and Reed-Sternberg（HRS）細胞より抽出した全RNA（1～5 ng）からSMARTer Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingを用いて作製したライブラリーの全トランスクリプトームシーケンス解析によって検証しました。
A multi-scale approach reveals that NF-κB cRel enforces a B-cell decision to divide.
Shokhirev, M. N. et al. Mol. Syst. Biol. (2015) 11, 783.
Bリンパ球集団における各細胞内の分子ネットワークのダイナミクスをシミュレーションする計算モデルを構築する過程で、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡検査法を補完する手段として、ハイスループットシングルセルmRNAシーケンス解析を使用しています。SMARTer Ultra Low RNA Kit for the Fluidigm C1 Systemを用いて、個々のB細胞のRNA-Seqライブラリーを作製しました。
The avian transcriptome response to malaria infection.
Videvall, E., Cornwallis, C. K., Palinauskas, V., Valkiunas, G. ＆ Hellgren, O. Mol. Biol. Evol. (2015) 32, 1255-1267.
鳥類マラリア原虫に感染したマヒワ（Spinus spinus）のトランスクリプトームの反応を、ハイスループットRNA-Seqにて定量しています。感染の様々なステージで採取した全血サンプルより抽出した全RNAからライブラリーを作製するため、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを使用しました。
Single cell dissection of early kidney development: multilineage priming.
Brunskill, E. W. et al. Development (2014) 141, 3093-3101.
著者らは、発生過程の腎臓で多様な細胞系列を生じる外見上均質な細胞集団の研究における最初の検討として、シングルセルRNA-Seqを用いて、細胞235個の網羅的発現プロファイルを評価しています。マウス腎臓（全体）から調製したシングルセル浮遊液からRNA-Seqライブラリーを作製するため、SMARTer Ultra Low RNA Kit for the Fluidigm C1 Systemを使用したところ、RNAプロセシングパターンをシングルセルレベルで特異的に評価できることが明らかになりました。
Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis.
Cabezas-Wallscheid, N. et al. Cell Stem Cell (2014) 15, 507-522.
細胞分化の様々な段階で発生する遺伝子発現の変化を詳細に検討することを目的として、造血幹細胞（HSC）および4種類の多能性前駆細胞（MPP）集団のプロテオーム、トランスクリプトーム、およびゲノム全体のメチロームデータを確立するため、希少細胞集団の解析に技術的進歩を使用しています。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて、10 ngの全RNAからcDNAライブラリーを作製しました。
Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors.
Chen, L. et al. Science (2014) 345, 1251033.
分化血球細胞の様々な発生段階を代表する8つの初代ヒト造血前駆細胞集団で得られたRNA-Seqデータを検討しています。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて、25個のpolyA RNAサンプルからRNA-Seqライブラリーを作製したところ、計2.4×109リードのユニークリード（36～150×106リード／サンプルの範囲）が得られました。
Long-term survival of influenza virus infected club cells drives immunopathology.
Heaton, N. S. et al. J. Exp. Med. (2014) 211, 1707-1714.
A型インフルエンザウイルス（IAV）感染後に生き残ったクララ細胞のRNA-SeqにSMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを使用し、これらの細胞の転写プロファイルが、類似の環境から採取した未感染細胞と異なることを示しています。これらのクララ細胞が、IAV感染により引き起こされる肺組織損傷の予防に重要な役割を果たすことを報告しています。
Transcriptome-wide RNA sequencing analysis of rat skeletal muscle feed arteries. I. Impact of obesity.
Jenkins, N. T. et al. J. Appl. Physiol. (2014) 116, 1017-1032.
次世代RNA-Seqテクノロジーを用いて、骨格筋の供給動脈における網羅的遺伝子発現に肥満が与える影響を調べています。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて完全長cDNA転写産物を合成した後、Illuminaライブラリーを作製しました。著者らは、大動脈血管内皮細胞に富むサンプルに含まれる計396種類の転写産物の発現状況が、肥満ラットと非肥満ラットの間で異なることを確認しました。
Transcriptome analysis of CD133-positive stem cells and prognostic value of survivin in colorectal cancer.
Kim, S. T. et al. Cancer Genomics and Proteomics (2014) 11, 259-266.
結腸直腸癌（CRC）幹細胞に特異的な遺伝子を特定するため、CRC患者の原発巣と転移巣の間で、細胞集団の発現プロファイルを比較しています。各標本のCRC細胞から全RNAを分離し、SMARTer Ultra Low Kit RNA for Illumina Sequencingを用いてRNA-Seqライブラリーを作製しました。
Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma.
Patel, A. P. et al. Science (2014) 344, 1396-1401.
SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いたシングルセルRNA-Seqにて、原発性膠芽腫の病巣内での転写不均一性を調べています。著者らは、同じ病巣内の細胞間で、機能および転写プロファイルに高度な多様性がみられることを確認しました。
Mapping Gene Regulatory Networks in Drosophila Eye Development by Large-Scale Transcriptome Perturbations and Motif Inference.
Potier, D. et al. Cell Rep. (2014) 9, 2290-2303.
この研究では、ショウジョウバエの眼発生における遺伝子制御ネットワークのリバース・エンジニアリングに、RNA-Seqを第一段階として使用しています。補足資料に示すように、ワンダリング期の3齢幼虫の各種組織（複眼原基、翅原基、脳）より抽出した全RNA（0.5～3 μg）から、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いてcDNAを作製しました。
Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation.
Shalek, A. K. et al. Nature (2014) 510, 363-369.
外観が同じ細胞間での遺伝子発現変動の程度、機序および機能を解明するため、ハイスループットのシングルセル・トランスクリプトミクスを検討しています。著者らは、数種類の実験条件に曝露したマウス骨髄由来初代樹状細胞から、1,700を超えるシングルセルRNA-Seqライブラリーを作製し、SMARTer Ultra Low RNA Kit for the Fluidigm C1 Systemを用いて、全トランスクリプトームを増幅しました。
The eSNV-detect: A computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data.
Tang, X. et al. Nucleic Acids Res. (2014) 42, e172.
この研究では、RNA-Seq実験（読み取り深度の浅い実験を含む）から得られる変異のコールおよびランク付けを行う新規計算システムの開発について論じています。MDA-MB-231乳癌細胞株から分離した16個のシングルセル（生細胞）から、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いてcDNAを作製し解析に供しました。シングルセルmRNA-Seqデータでは、従来の複数細胞のRNA-Seqデータで明らかにならなかった変異についてシングルセル間の不均一性が示され、候補変異31個中29個が、サンガー法によるシーケンス解析にて検証されました。
Hematopoietic Stem Cells Are Intrinsically Protected against MLL-ENL-Mediated Transformation.
Ugale, A. et al. Cell Rep. (2014) 9, 1246-1255.
この論文は、あらゆる種類の細胞内のmixed-lineage leukemia/eleven-nineteen-leukemia（MLL-ENL）転写因子を特定条件で活性化できるマウスモデルの作製を報告しています。この新規モデルは、様々な造血前駆細胞サブセットから発生する急性骨髄性白血病（AML）の相違点を研究するのに利用できます。計2,000個の造血幹細胞および顆粒球-マクロファージ前駆細胞の前駆細胞から抽出した全RNAを用いて、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina SequencingによりRNA-Seqライブラリーを作製しました。著者らは、造血過程の一部の段階で分化が阻害されることが、白血病発症の主な初期イベントであることを明らかにしました。
Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.
Wu, A. R. et al. Nat. Methods (2014) 11, 41-46.
シングルセルからのcDNA合成を用途とする市販キットを比較しています。著者らは、シングルセルRNA-Seqが、定量的トランスクリプトーム解析方法として実施可能かつ再現性のある手法であることを裏付けるデータを示しています。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina SequencingとSMARTer Ultra Low RNA Kit for the Fluidigm C1 Systemの両キットが評価されました。
Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.
Brennecke, P. et al. Nat. Methods (2013) 10, 1093-1095.
生物学的変動と技術的変動を識別するための統計学的手法を提示しています。哺乳類および植物の組織から抽出した全RNAサンプルを、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingのインプットとして使用し、この統計学的アプローチを検証しました。
Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons.
Henley, B. M. et al. Biochem. Pharmacol. (2013) 86, 1074-1083.
パーキンソン病において喫煙が神経保護効果を示す可能性について評価しています。レーザーマイクロダイセクション（LCM）によって20個のニューロンを採取し、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いてcDNAを合成しました。各シーケンス解析用ライブラリーのユニークマップされたリード数は、2,000万リード超でした。この論文には、ニコチン投与後の黒質緻密部（SNc）ニューロンの全トランスクリプトーム解析が初めて報告されました。
Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons.
Kadkhodaei, B. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2013) 110, 2360-2365.
神経発達および神経疾患における転写因子Nurr1の役割を検討しています。Nurr1はパーキンソン病の特徴と関連を示します。mRNA-Seqによって、Nurr1による調節を受ける遺伝子が同定されたほか、ドパミン作動性（DA）ニューロンに発現する遺伝子の活性化にNurr1が果たす役割が明らかになりました。cDNAライブラリーを作製するため、1週齢マウスのDAニューロンをレーザーマイクロダイセクションにて採取し、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いてRNAを抽出しました。
Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells.
Shalek, A. K. et al. Nature (2013) 498, 236-240.
骨髄由来樹状細胞（BMDC）をリポ多糖類（LPS）に曝露した後の反応を、シングルセル単位で評価しています。SMART-Seqテクノロジー（SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing、タカラバイオ）を用いて、BMDCのシングルセルからcDNAを合成しました。
Dynamics of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine during germ cell reprogramming.
Yamaguchi, S. et al. Cell Res. (2013) 23, 329-339.
始原生殖細胞（PGC）のリプログラミング過程における5-メチルシトシン（5mC）とその酸化体のダイナミクスを検討しました。ソーティングにより分取した300～5,000個のPGCから全RNAを精製し、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いてcDNAを合成・増幅しました。
mRNA-Seq of Single Prostate Cancer Circulating Tumor Cells Reveals Recapitulation of Gene Expression and Pathways Found in Prostate Cancer.
Cann, G. M. et al. PLoS One (2012) 7, e49144.
MagSweeperテクノロジーを用いた循環腫瘍細胞（CTC）の単離が報告されています。この分離技術は、CTCの生存率に悪影響を及ぼさないこと、また、前立腺癌細胞株の転写プロファイルを変化させないことが確認されました。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて、CTCのシングルセルmRNA-Seq解析に用いるcDNAを合成しました。シングルセル単位で抽出したRNAの品質にはばらつきがありましたが、このSMARTer Ultra Lowキットの使用により、mRNA-Seqに使用するのに十分な品質および量のcDNAを合成できました。
Metalloproteinases and their associated genes contribute to the functional integrity and noise-induced damage in the cochlear sensory epithelium.
Hu, B. H. et al. J. Neurosci. (2012) 32, 14927-14941.
RNAシーケンス解析およびqRT-PCRによる遺伝子発現解析を用いて、音響外傷に対する蝸牛反応におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）とその関連遺伝子産物の役割を検討しています。蝸牛感覚上皮から抽出したRNAをプールし、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて、8～10 ngの全RNAからcDNAを合成しました。この研究の結果は、MMPが騒音性難聴の治療標的として有用である可能性を示唆しています。
Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.
Ramsköld, D. et al. Nat. Biotechnol. (2012) 30, 777-782.
この論文は、Illumina社製システムによるシーケンス解析用のSMARTer Ultra Lowキットの原理であるSMART-Seq法について報告しています。この手法によって、シングルセルレベルのインプット量からのリードカバレッジが、従来のcDNA合成法と比較して向上し、一塩基多型（SNP）および転写アイソフォームの同定が可能となりました。この論文の発表後、超微量RNAおよびシングルセル用の新たなcDNA合成キットが開発されました。このキットは、特にGC含有量の高い遺伝子について、高品質のRNA-Seqデータを収集するのに役立ちます。
Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility.
Qiu, S. et al. Front. Genet. (2012) 3, 124.
単一ニューロンのRNA-Seqと電気生理学的解析を組み合わせたプロトコールの開発を報告しています。電気生理学的解析後、微細ガラス電極の先端部を用いた吸引により、脳切片から単一ニューロンの内容物を抜き取りました。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて、cDNAライブラリーを作製しました。
技術比較
Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.
Shanker, S. et al. J. Biomol. Tech. (2015) 26, 4-18.
この論文は、pgレベルのRNAに対応する市販RNA-Seqキットの精度および性能を評価しています。4種類のキットを3段階の濃度（50 pg～5 ng）の市販RNAとともに使用しました。評価は複数の施設で実施しました。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて作製したライブラリーは、rRNA除去を原理とする方法で作製したライブラリーと比較して、エクソンリードの割合が大幅な高値を示しました。このキットは、ユニークリード率が最も高く、希釈系列間での一致度が最も高値でした。
Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.
Adiconis, X. et al. Nat. Methods (2013) 10, 623-629.
市販のcDNA合成方法に低品質または少量のRNAをインプットとして使用し、生成したシーケンスメトリクスを体系的に比較しています。著者らは、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて、少量のサンプルからRNA-Seq用cDNAを作製したとき、rRNAにマップされたリードの割合が顕著に低く、エクソンにマップされたリードの割合が相対的に高かったことを報告しています。
ポスター
cDNA library generation for transcriptome analysis from total RNA equivalent to a single cell.
Bostick, M. et al. J. Biomol. Tech. (2013) 24(Suppl), S43.
このポスターは、SMARTer Ultra Low法を用いて優れたトランスクリプトームデータが得られることを明示しています。SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingを用いて得られたデータは、インプットRNA量が0.1 ngの条件でも、MicroArray Quality Control（MAQC）データと高い相関を示しました。
RNA-seq transcriptome profiling of individual Rhesus macaque oocytes and pre-implantation embryos.
Chitwood, J.L. et al. Reprod. Fertil. Dev. (2013) 26, 179.
このポスターは、アカゲザルの卵母細胞および胚のトランスクリプトーム解析にSMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingが使用されたことを報告しています。
Evaluation of whole transcriptome amplification methods by RNA-seq.
Zueckert-Gaudenz, K. et al. J. Biomol. Tech. (2013) 24(Suppl), S57-S58.
この研究では、SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencingと、少量RNAに対応する他の3種類の市販微量RNA-Seq用ライブラリー調製キットを比較しています。SMARTerキットを用いて全RNAから作製したcDNAライブラリーは、すべての評価基準で優れた性能を示しました。
