In situ Apoptosis Detection Kitを用いた多重染色像
（千葉大学理学部生物学教室 遠藤 剛 先生のご好意により掲載）12）
蛍光三重染色によるアポトーシス観察の手順
＜細胞培養＞
↓ 増殖培地中で培養したマウスC2筋芽細胞をカバーガラス(18×18 mm)上にまく
↓ 分化培地に交換し、24～96時間培養する
＜固 定＞
↓10％ ホルマリン(3.7％ ホルムアルデヒド) in PBS､室温で15分
↓洗浄 PBS×3回
※この状態で4℃で保存可能
＜浸透化＞
↓0.2％ Triton X-100 in PBS､室温で5分(またはPermeabilization Buffer､氷上で2～5分)
↓洗浄 PBS×3回
＜一次抗体反応＞
↓モノクローナル抗体MF20、室温で50分
↓洗浄 PBS × 4回
＜FITC-dUTP標識 ＋ 二次抗体反応＞
↓Labeling Safe Buffer 50 μl ＋ TdT 5 μl ＋ Rhodamine-anti-mouse IgG､37℃で60分
＜Hoechst 33258染色＞
↓1 μg/ml Hoechst 33258､室温で1分
↓洗浄 PBS×4回
＜包 埋＞
↓1 mg/ml p-フェニレンジアミンを含む20％ グリセロール in PBS
↓カバーグラスの周囲をマニキュアで封ずる
＜蛍光顕微鏡による観察＞
図 蛍光三重染色によるアポトーシスと分化細胞の検出
(A)位相差像。アポトーシス細胞に焦点を合わせてあるため、生細胞はあまり明瞭ではない。
(B)Hoechst 33258による核DNAの染色。
(C)MF20抗体によるミオシン重鎖発現細胞（分化細胞）の検出。
(D)FITC-dUTP標識によるアポトーシス細胞核の検出。
スケールバー: 20 μm
＜細胞培養＞
↓ 増殖培地中で培養したマウスC2筋芽細胞をカバーガラス(18×18 mm)上にまく
↓ 分化培地に交換し、24～96時間培養する
＜固 定＞
↓10％ ホルマリン(3.7％ ホルムアルデヒド) in PBS､室温で15分
↓洗浄 PBS×3回
※この状態で4℃で保存可能
＜浸透化＞
↓0.2％ Triton X-100 in PBS､室温で5分(またはPermeabilization Buffer､氷上で2～5分)
↓洗浄 PBS×3回
＜一次抗体反応＞
↓モノクローナル抗体MF20、室温で50分
↓洗浄 PBS × 4回
＜FITC-dUTP標識 ＋ 二次抗体反応＞
↓Labeling Safe Buffer 50 μl ＋ TdT 5 μl ＋ Rhodamine-anti-mouse IgG､37℃で60分
＜Hoechst 33258染色＞
↓1 μg/ml Hoechst 33258､室温で1分
↓洗浄 PBS×4回
＜包 埋＞
↓1 mg/ml p-フェニレンジアミンを含む20％ グリセロール in PBS
↓カバーグラスの周囲をマニキュアで封ずる
＜蛍光顕微鏡による観察＞
図 蛍光三重染色によるアポトーシスと分化細胞の検出
(A)位相差像。アポトーシス細胞に焦点を合わせてあるため、生細胞はあまり明瞭ではない。
(B)Hoechst 33258による核DNAの染色。
(C)MF20抗体によるミオシン重鎖発現細胞（分化細胞）の検出。
(D)FITC-dUTP標識によるアポトーシス細胞核の検出。
スケールバー: 20 μm
