PerfectShot™ Ex Taq (Loading dye mix)

1983年、Marshall & Warrenによって発見されたHelicobacter pyloriは胃炎の原因菌で、発見以来、胃潰瘍をはじめとする種々の胃疾患との関連が注目されている。H. pyloriの発育は非常に遅く、培養での分離には1週間を要するが、PCRを用いれば、開始から遅くとも7時間後には、結果を判定することができる。しかし、胃炎患者より採取された胃生検材料を用いてPCR検出を行う際、通常のTaq DNA Polymeraseを用いたPCRでは、非常に増幅されにくいテンプレートDNAが存在する。今回、これらのテンプレートDNAを用い、高増幅型のDNA PolymeraseであるTaKaRa Ex Taqと通常のTaq DNA Polymeraseとの検出感度の比較データを神戸市環境保健研究所 細菌部の黒川 学先生よりご提供いただいたので、以下に示す。

胃生検材料
↓ 細胞溶解 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　↓	100 μl細胞溶解液を加える 94℃、15分加熱 9 UのProteinase Kを加える 60℃、60分加熱
DNA抽出 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　↓	300 μlのDNA抽出液を加える 1分、緩やかに撹拌 10,000 rpm、3分遠心 上清に500 μlのエタノールを加え撹拌 10,000 rpm、1分遠心 沈渣をエタノールで2回洗浄 乾燥後100 μlのTE Bufferに溶解
PCR 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　│ 　　　↓	熱変性 ： 94℃、30 sec   30 cycles アニーリング ： 45℃、90 sec 伸　長 ： 72℃、60 sec ↓ 熱変性 ： 94℃、30 sec   10 cycles アニーリング ： 45℃、90 sec 伸　長 ： 72℃、60 sec
検　出 　　　│ 　　　│ 　　　↓	アガロース電気泳動 EtBr染色
判　定

図1 胃生検材料からのPCR法によるHelicobacter pyloriの検出

従来のTaq DNA Polymeraseでは、バンドがほとんど認められない検体でも、TaKaRa Ex Taqを用いれば明瞭なバンドを確認することができた（図2）。

図2 耐熱性ポリメラーゼの種類による増幅率のちがい

Lane 1：	H. pylori NCTC11637	Taq
Lane 2：	胃生検（1）
Lane 3：	胃生検（2）
Lane 4：	胃生検（3）
Lane 5：	H. pylori NCTC11637	TaKaRa Ex Taq
Lane 6：	胃生検（1）
Lane 7：	胃生検（2）
Lane 8：	胃生検（3）
Lane 9：	マーカー

PCR反応液組成

Template DNA	10 μl
TaKaRa Ex Taq or Taq DNA Polymerase	2.5 U
10 × Ex Taq Buffer or PCR Buffer
dNTP Mixture	200 μl
forward and reverse primer*	各0.2 μl

* ウレアーゼA遺伝子を増幅するプライマー
HPUA-1（5'-GCCAATGGTAAATTAGTT 3' : 304-321）
HPUA-2（5'-CTCCTTAATTGTTTTTAC 3' : 714-697）

培養法とPCR法との具体的な検出感度の違いと問題点について、弊社定期発刊誌「BIO VIEW 17号」にて神戸市環境保健研究所 細菌部の黒川 学先生にご執筆いただいております。詳しくはそちらをご覧ください。