PerfectShot™ Ex Taq (Loading dye mix)

テンプレートDNAがGC richである場合、従来のTaqDNA Polymeraseを用いたPCRでは増幅しにくいことがよくある。TaKaRa LA TaqおよびTaKaRa Ex Taqは従来のTaqDNA Polymeraseに比べて増幅効率が優れているため、一般的に増幅しにくいこのようなDNAフラグメントの増幅も可能である。
以下に、GC含量が70%ときわめて高い3 kbpのフラグメントを増幅した例を示す。
図1は通常のTaqDNA PolymeraseとTaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2での増幅を比較した。通常のTaqでは増幅できないGC richなフラグメントがTaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2では良好な増幅が確認できる。
このようにGC richなフラグメントでは、図1のようにdGTPの代わりに7-deaza-dGTPを使用するとよい結果が得られる場合がある。また、より増幅効率を高めたい時は、dGTPと7- deaza-dGTP (あるいはdITP) とを混合して用いるとよい結果が得られる (図2) 。
増幅したいフラグメントの種類により最適なdGTPと7-deaza-dGTP (あるいはdITP) との混合比率は変化するので、さまざまな条件を検討し、至適条件を決定することをお勧めする。

*Primer配列
　M3-30 (M3 Primerを長くしたもの)
　 　　5'-CAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'
　RV-32 (RV Primerを長くしたもの)
　 　　5'-GATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'

Template	：	VIII-5-pUC118 (GC richなフラグメント約3 kbpをHind IIIで切断したpUC118に挿入したもの)
増幅サイズ	：	約3 kbp
Primer*	：	Custom long primer (30～32 mer) (各10 pmol/50 μl PCR)
dNTP Mixture	：	dGTPの代わりに7-deaza-dGTP使用
PCR条件	：	94℃、1 min 　↓ 98℃、20 sec 68℃、5 min 30 cycles

(TaKaRa PCR Thermal Cycler 480使用)

図1 GC richなフラグメントの増幅の比較

1% L 03 Agarose gel (製品コード 5003)
8 μl泳動

Lane 1：Taq Lane 2：TaKaRa Ex Taq Lane 3：TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2

を用いて増幅

Lane M1：λ-Hind III digest
Lane M2：λ-EcoT14 I digest

図2 dGTPと7-deaza-dGTP、dITPとの割合とGC richなフラグメントの増幅の比較

1% L 03 Agarose gel (製品コード 5003)
10 μl泳動

Lane 1：dGTP：dITP = 3：1 Lane 2：dGTP：7-deaza-dGTP = 3：1 Lane 3：7-deaza-dGTPのみ

TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2を用いて増幅

Lane 4：dGTP：dITP = 3：1 Lane 5：dGTP：7-deaza-dGTP = 3：1 Lane 6：7-deaza-dGTPのみ

TaKaRa Ex Taq を用いて増幅

Lane M：pHY Marker