3'-Full RACE Core Set

ヒトトランスフェリンレセプターmRNAをターゲットにした3'-RACE

HL60由来total RNAを用いてヒトトランスフェリンレセプターmRNAをターゲットにして3'-RACE法を行った。

A．RT-PCR

  1. 逆転写反応
    Standard Protocolにしたがって反応液を調製し、逆転写反応を行う。

    サンプル：HL60由来total RNA（1 μg/μl）

    反応条件

    30℃、 1 min1 cycle
    50℃、30 min
    95℃、5 min
    5℃、 5 min
  2. PCR反応（TaKaRa LA Taq 使用）
    A. -1. の逆転写反応液を用いて下記の反応液を調製し、Standard ProtocolにしたがいPCR反応を行う。
    10×LA Taq Buffer II（Mg2＋ free） 5 μl
    25 mM MgCl2 5 μl
    dNTP Mixture（2.5 mM each） 8 μl
    TaKaRa LA Taq（5 U/μl） 0.25 μl
    上流特異的プライマー*（20 μM） 0.5 μl
    3sites Adaptor Primer（20 μM） 0.5 μl
    1. の逆転写反応液 10 μl
    滅菌精製水 20.75 μl
    Total 50 μl
    * 5'末端にBamH I site含む配列を付加したプライマー
  3. 反応終了後、アガロース電気泳動により反応産物を確認する。
    Lane M：λ-Hind III digest
    1：3'-RACE PCR産物（約1.5 kbp）
    1％アガロースゲル電気泳動
    8 μl泳動

B．PCR産物の回収

DNA回収用フィルター付き遠心チューブを使用してPCR産物を精製する。

C．制限酵素消化

プラスミドベクター pUC118 BamH I/BAP（製品コード 3321）にサブクローニングするため、PCR産物のBamH I 処理を行う。 下記の反応液を調製し、30℃で1時間インキュベートする。

PCR産物2 μl（500 ng～1 μg）
10 U/μl BamH I 1 μl
10×Buffer K1 μl
滅菌精製水up to 50 μl

D．ライゲーション反応

pUC118 BamH I/BAPとC. のBamH I 処理PCR産物（約1.5 kbp）のライゲーション反応を行う。[DNA Ligation Kit Ver. 2 （製品コード 6022）使用]
下記の反応液を調製し、16℃で1時間反応させる。

C. で調製したPCR産物6.5 μl（200 ng）
pUC118 BAP処理DNA0.5 μl（50 ng）
Enzyme Solution I液7 μl
Total14 μl
E．形質転換

E. coli JM109 competent Cells（製品コード 9052）に形質転換を行った後、アンピシリン、IPTG、X-Galを含むLB-plateにスプレッドし、37℃、18時間培養する。培養後、白色コロニーを拾う。
M4 PrimerとRV PrimerによるPCRでインサートの確認されたコロニーをLB培地で培養後、プラスミドを回収する。
この塩基配列解析を行った結果、目的のフラグメントが挿入されていることが確認された。

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