N末端ブロックタンパク質のＮ末端シーケンス解析法

タンパク質（100 pmol-1 nmol）^*
　 ↓
PVDF膜を洗浄する（下記実験例参照）
　 ↓
PVDF膜のunbound protein-binding siteをブロックする（下記実験例参照）
　 ↓
Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase消化を行う
　 ↓
プロテインシーケンサーにかける

* タンパク質試料が溶液状態であれば、酸処理、熱処理、還元アルキル化等の方法により変性させた後、PVDF膜にドットブロットする。

Pfu Pyroglutamate Aminopeptidaseの標準反応条件

緩衝液：10 mM DTT, 1 mM EDTAを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0
反応温度：50℃
酵素/基質：2～5 mU酵素/1 nmol基質
反応時間：5～10時間

PVDF膜にブロットされたEgg white riboflavin binding protein（RBP）のN末端デブロッキング

RBPはN末端がピログルタミン酸であり、分子量34,000である。（Pfu Pyroglutamate Aminopeptidaseを用いて）PVDF膜にブロットされたこのタンパク質のN末端ピログルタミン酸を切断した。

実験条件

500 pmol/ PVDF膜
　 ↓
PVDF膜をサンプルチューブに入れ、60％メタノール 1 ml×2回、90％メタノール 1 ml×1回、手で振とうして洗浄する。
（90％メタノールは入れたらすぐ液を除く。：あまり長くメタノール液に浸しておくとサンプルが流れ出てしまうので注意が必要。）
↓
0.5%（w/v）のpolyvinylpyrrolidone（PVP）-55含有100 mM酢酸溶液に500μlに37℃で30分間浸す。
　↓
膜を蒸留水で少なくとも10回以上撹拌洗浄する。
　↓
膜をメタノールで湿らせる。
　↓
酵素消化を行う。
　｜Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase（2 mU）　10 μl
　｜100 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）　100 μl
　｜100 mM DTT　20 μl
　｜蒸留水　70 μl
　↓total　200 μl
50℃で5時間インキュベートする。
　↓
膜を蒸留水で3回撹拌洗浄する。
　↓
シーケンサーでアミノ酸配列分析を行う。

結果

以下の結果からN末端ピログルタミン酸の次のアミノ酸からの配列を［＜Q］QYG（C）LEGDTHと同定できた。
（＜Q：ピログルタミン酸）

サイクル	アミノ酸	収量（pmol）
1	Gln	39.7
2	Tyr	42.1
3	Gly	37.5
4	（Cys）	-
5	Leu	36.7
6	Glu	77.7
7	Gly	32.9
8	Asp	56.6
9	Thr	8.6
10	His	16.3