シアル酸蛍光標識用試薬キット

PA化糖鎖スタンダード021、023、024、025各2.5 μl（約25 pmol相当、図4）を0.05 N HCl 50 μl中、80℃で1時間加熱し、シアル酸を遊離させた。

021

023

024

025

図4 PA化糖鎖スタンダード

PA化糖鎖スタンダード021、023、024、025各2.5μl（約25 pmol相当）を基質とし、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）50 μl中、Arthrobacter ureafaciens由来シアリダーゼ100 mUを加えて、37℃で30分間反応させた後、100℃で3分間加熱して酵素反応を終了した。

（1）または（2）で得られたサンプルをキットのプロトコールに従ってDMB標識を行った反応液のうち10 μlを図2に示したHPLC条件で分析を行った（一例として、PA化糖鎖スタンダード021のHPLC分析パターンを図5に示した）。
サンプルのHPLCのピークの高さと、サンプルと同時に実験を行ったシアル酸スタンダードのピークの高さを比べることによって、サンプル中のシアル酸の定量を行うことができた。結果を表1に示した。

図5 PA化糖鎖スタンダード021DMB化遊離シアル酸のHPLC分析

PA化糖鎖スタンダード021、023、024、025各5 μl（約50 pmol相当）をガラスチューブに入れ濃縮乾固し、5.7 N定沸点塩酸50 μlを加えて減圧封管した。それを100℃で16時間加熱することにより酸水解を行った。開管後濃縮乾固させ、水を少量加えて共沸し、塩酸を完全に留去した。残渣に新しく調製した飽和NaHCO₃水溶液を48 μl加えて溶かし、反応液が弱塩基性になっていることを確かめた後、無水酢酸2 μlを加えよく撹拌した。15分間室温に放置した後、さらに48 μlの飽和NaHCO₃水溶液と2 μlの無水酢酸を加え、よく撹拌後30分間室温に放置し、N-アセチル化を行った。反応液のうち20 μlを図3に示したHPLC条件で分析を行った（一例として、PA化糖鎖スタンダード021のHPLC分析パターンを図6に示した）。サンプルのHPLCのピークの高さと、サンプルと同時に実験を行ったPA-GlcNAcスタンダードのピークの高さを比べることによって、還元末端のPA-GlcNAcの定量を行った。結果を表1に示した。（3）で求めたシアル酸量をPA-GlcNAc量で割り算することによって、糖鎖1モル当たりの結合シアル酸のモル数を求めることができる（表1）。

表1 PA化糖鎖スタンダードの糖鎖あたりの結合シアル酸数

PA化糖鎖 スタンダード	Neu5Ac（pmol/μl）		PA-GlcNAc （pmol/μl）	糖鎖あたりの結合シアル酸数（個）
	酸水解	酵素消化		酸水解	酵素消化
021	13.0	12.9	11.6	1.1	1.1
023	25.0	26.1	11.2	2.2	2.3
024	59.7	60.8	18.6	3.2	3.3
025	58.9	65.0	14.7	4.0	4.4

図6 PA化糖鎖スタンダード021の還元末端のHPLC分析