RetroNectin^® GMP grade

【方法】

GFP遺伝子をpDON-AIのBamH I部位に挿入して、組換えレトロウイルスベクタープラスミドpDON-AI-GFPを作製した。これをパッケージング細胞にトランスフェクションして、GFPを発現する組換えレトロウイルスを作製した。組換えレトロウイルスベクタープラスミドの構造と、標的細胞のゲノムに組み込まれたときのプロウイルスDNAの構造を以下に示す。

以下に示すフローチャートに従って、まずCD34⁺造血幹細胞のプレスティミュレーション（前刺激）、RetroNectinプレートの準備を行った。次に調製した組換えレトロウイルス（DON-AI-GFP）を、RetroNectinプレート上で、あるいはポリブレン存在下で、CD34⁺造血幹細胞に感染させ、GFP遺伝子を導入した。細胞を回収した後、GFPを発現している細胞の割合をFACSで分析し、両者の条件における遺伝子導入効率を比較した。

CD34⁺造血幹細胞のプレスティミュレーションRetroNectinコートプレートの準備CD34⁺造血幹細胞への遺伝子導入

	細胞ストック（1×106 cells）を37℃で溶解
	↓
	20％ FBS含有IMDM 10 mlで希釈
	↓
	10 cmφの未処理ディッシュに添加
	↓
	増殖因子添加（100 ng/ml SCF、20 ng/ml IL-3、50 ng/ml IL-6）
	↓
	37℃、5％ CO2、48時間培養
	↓
	細胞数を測定し、2×106 cellsになるように懸濁
	RetroNectin（1 mg/ml）をPBSで80 μg/mlになるように希釈
	↓
	24穴未処理プレートに0.5 ml添加（20 μg/cm2）
	↓
	室温、2時間インキュベーション
	↓
	上清を除き、2％ BSA/PBS溶液を500 μl添加し、 室温で30分間ブロッキング
	↓
	ウェルをHBSSで洗浄
	CD34+造血幹細胞（2×104 個/well） ウイルス液（DON-AI-GFP；m.o.i＝5） 増殖因子（100 ng/ml SCF、20 ng/ml IL-3、50 ng/ml IL-6）＊
	↓
	これらをmixし、RetroNectinコートプレートに添加
	↓
	37℃、5％ CO2、4時間培養
	↓
	20％ FBS含有IMDM 0.5 mlに培地交換
	↓
	37℃、5％ CO2、48時間培養
	↓
	細胞を回収してGFP発現細胞をFACSで解析
＊：	ポリブレンを用いる条件では、さらに7.5 μg/mlのポリブレンを添加し、 RetroNectinコートプレートを用いずに培養を行った。

【結果】

RetroNectinコートプレート上で組換えレトロウイルスをCD34⁺造血幹細胞に感染させた場合の遺伝子導入効率（GFP遺伝子を発現している細胞の割合）は25.8％であった。一方、ポリブレンを用いた場合の遺伝子導入効率は0.3％であった。RetroNectinを用いることにより、CD34⁺造血幹細胞への遺伝子導入効率が高まることが確認できた。

A
B

A：FACSによるGFP発現細胞の解析
B：ポリブレンまたはRetroNectin使用条件における遺伝子導入効率