Anti-Bovine Osteocalcin

各種抗OC抗体を用いて、ラット脛骨の免疫組織染色した例を以下に示す。

【方法-組織切片の調製】

材　　料	：	ラットの脛骨
操作手順	：	1）	PLP固定
		2）	10% EDTAによる脱灰 4℃、1週間
		3）	アセトン 4℃、一晩
		4）	アセトン 室温30分、4回
		5）	メチル安息香酸 室温30分、2回
		6）	キシレン 室温30分、2回
		7）	パラフィン 60℃、30分、4回
		8）	パラフィン包埋
		9）	薄切

＊：ステップ3）～9）はAMeX変法（新鮮凍結切片に準じた抗原性の保持が可能）による。

【方法-免疫組織染色】

一次抗体	：	OC4-30	10000倍希釈（0.2 μg/ml）
		OCG3	5000倍希釈（0.4 μg/ml）
		GluOC4-5	10000倍希釈（0.2 μg/ml）
検出方法	：	sABCシステム（DAKO社）
操作手順	：	1）脱パラフィン
		2）非特異的タンパク質のブロッキング
		3）一次抗体 4℃、一晩
		4）ビオチン標識二次抗体 室温30分
		5）内因性ペルオキシダーゼのブロッキング
		6）Strept ABComplex 室温30分
		7）DAB反応
		8）対比染色（メチルグリーン）
		9）脱水・透徹・封入

【結果】

評価した3種の抗OCモノクローナル抗体は、ラット由来のOCとも交差反応し、ラットの組織でも使用できることが確認できた。Gla型OCを認識するOC4-30抗体は、一部の骨芽細胞や骨細胞とも反応したが、主に骨基質に強く反応した（図1のA-D）。
Gla型とGlu型の両方のOCを認識するOCG3抗体は、骨基質と共に骨芽細胞や骨細胞に反応した（図1のE-H)。
一方、Gla化される前段階のOCの21位、24位のGlu（E）残基を認識するGluOC4-5抗体は、骨基質に反応せず、ある時期（生後15～17日）の骨芽細胞に強く反応した。