siRNA発現レトロウイルスによるノックダウン
GFPのターゲット配列（GGAGTTGTCCCAATTCTTG）に対するヘアピン型RNA発現のためのオリゴDNA（下記）を合成し、それをpSINsi-hH1、pSINsi-hU6、pSINsi-mU6のBamH I-Cla I部位に挿入し、siRNA発現用レトロウイルスベクタープラスミドを構築した。ネガティブコントロールとして、ターゲット配列に対するスクランブル配列（GTTACTTGAGCTCGTACGT）を用意した。
Retrovirus Packaging Kit Amphoを用いて293T細胞で一過性にアンフォトロピックウイルス産生を行い、NIH/3T3細胞で力価を測定した。
GFPを安定に発現しているNIH/3T3細胞（マウス由来）およびHT1080細胞（ヒト由来）に、GFPに対するヘアピン型RNAを発現するレトロウイルスベクター（Ampho-SINsi-hH1-GFP、Ampho-SINsi-hU6-GFP、Ampho-SINsi-mU6-GFP）、およびネガティブコントロールベクター（Ampho-SINsi-hU6-Nc）をMOI = 0.1以下の条件でポリブレン法によって感染した。感染細胞はG418培地で二週間選択の後、GFPの蛍光強度をフローサイトメーターで測定し、GFP蛍光強度の低下を算出した（図）。siRNA発現レトロウイルスによるRNAi効果が確認された。
|
Retrovirus Packaging Kit Amphoを用いて293T細胞で一過性にアンフォトロピックウイルス産生を行い、NIH/3T3細胞で力価を測定した。
力価（cfu/ml） SINsi-hH1-GFP 1.3×106 SINsi-hH6-GFP 1.6×106 SINsi-mU6-GFP 0.7×106
GFPを安定に発現しているNIH/3T3細胞（マウス由来）およびHT1080細胞（ヒト由来）に、GFPに対するヘアピン型RNAを発現するレトロウイルスベクター（Ampho-SINsi-hH1-GFP、Ampho-SINsi-hU6-GFP、Ampho-SINsi-mU6-GFP）、およびネガティブコントロールベクター（Ampho-SINsi-hU6-Nc）をMOI = 0.1以下の条件でポリブレン法によって感染した。感染細胞はG418培地で二週間選択の後、GFPの蛍光強度をフローサイトメーターで測定し、GFP蛍光強度の低下を算出した（図）。siRNA発現レトロウイルスによるRNAi効果が確認された。
