DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞

pUC118 Hind III/BAP (製品コード 3324) (50 ng, 25 fmol) に、564 bpのλDNA由来のHind III断片 (2.5～150 fmol) を加えたDNA溶液7.5 μlにLigation Mix 7.5 μlを加え、16℃で30分間反応した。反応液のうち10 μlで、E. coli JM109コンピテントセル (7.3×10⁸ cfu/μg pUC118) を形質転換し、X-Gal、IPTGを含むL-ampプレート上でコロニーを形成させ、コロニー数を計測して形質転換効率を調べた。結果を以下に示す。

Insert/vector (モル比)	形質転換効率 (colonies/μg vector)		白コロニー率 (%)
	white	blue
-	3.8×104	2.5×105	13.0
1/10	5.6×105	2.4×105	70.2
1/4	1.1×106	2.4×105	82.9
1	4.3×106	2.4×105	92.6
3	8.2×106	3.3×105	96.2
6	9.1×106	2.4×105	97.4

pUC118 Hinc II/BAP (製品コード 3322) (50 ng, 25 fmol) に、500 bpのλDNA由来のHinc II断片 (2.5～150 fmol) を加えたDNA溶液7.5μlにLigation Mix 7.5 μlを加え、16℃で30分間反応した。反応液のうち10 μlで、E. coli JM109コンピテントセル (7.3×10⁸ cfu/μg pCU118) 100 μlを形質転換し、X-Gal、IPTGを含むL-ampプレート上でコロニーを形成させ、コロニー数を計測して形質転換効率を調べた。結果を以下に示す。。

Insert/vector (モル比)	形質転換効率 (colonies/μg vector)		白コロニー率 (%)
	white	blue
-	1.6×104	2.1×105	6.7
1/10	5.6×105	2.3×105	70.6
1/4	1.1×106	2.2×105	83.0
1	4.2×106	3.0×105	93.4
3	7.5×106	2.6×105	96.7
6	6.7×106	3.7×105	94.8

得られた白色コロニーについて、PerfectShot Insert Check PCR Mix (製品コード RR020A) を用いてインサートチェックを行った。

Insert	Insert：Vector
	0.1：1	3：1
λ564/Hind III	21/24	24/24
λ500/Hinc II	24/24	22/24

Insert/Vector比は1以上で効率よく陽性クローンを得ることができ、6以上では、形質転換効率が低くなる場合があります。Insert/Vector比を3程度として実験することをお勧めします。
また、Insert DNAの鎖長が短いとマルチライゲーション (Insert DNAが複数つながってVectorに挿入される反応) の頻度が高くなります。マルチライゲーションはInsert/Vector比が高い程起こりやすくなるので、マルチライゲーションの頻度が高い場合は、Insert/Vector比を下げて検討してください。