Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End)

(A)PCR産物をそのまま使用した場合

λ DNAを鋳型とし、PrimeSTAR HS DNA Polymeraseを用いて500 bp、1 kbp、2 kbp、4 kbp、6 kbpの領域をPCR増幅した。それぞれの反応液2 μlを本キットのプロトコールに従って平滑化、リン酸化し、pUC118 HincII / BAPにクローニング後、E. coli JM109 コンピテントセルを形質転換してカラーセレクションを行った。なお、インサートの有無はPCR（プライマー ; M13 Primer M4およびRV）によって確認した。

インサートDNA鎖長	白色コロニー／青色コロニー （/50 ng pUC118 DNA）	インサート／白色コロニー
500 bp	1.8×105 / 8.8×103	10 / 10
1 kbp	1.2 ×105 / 5.8×103	10 / 10
2 kbp	2.2 ×104 / 7.5×103	8 / 10
4 kbp	1.8 ×104 / 1.4×104	9 / 10
6 kbp	8.9 ×103 / 2.0×104	8 / 10

※使用したコンピテントセルは3.9×10⁸ コロニー/μg pUC118 DNAの形質転換効率を持つ。

(B)アガロースゲルから回収したフラグメントを用いた場合

λ DNAを鋳型としてTaKaRa Ex Taqを用いて増幅した500 bp、及びヒトGenomic DNAを 鋳型としてPrimeSTAR HS DNA Polymeraseを用いて増幅した2 kbpのPCR産物を、アガロースゲル電気泳動後、EASYTRAP Ver.2を使用してゲルから回収した。500 bpは2 pmol相当（約660 ng）、2 kbpは0.2 pmol相当（約250 ng）のDNAを本キットのプロトコールに従って平滑化、リン酸化し、pUC118 Hinc II / BAPにクローニング後、 E. coli JM109 コンピテントセルを形質転換してカラーセレクションを行った。なお、インサートの有無はPCR（プライマー ; M13 Primer M4およびRV）によって確認した。

インサートDNA鎖長	白色コロニー／青色コロニー （/50 ng pUC118 DNA）	インサート／白色コロニー
500 bp	1.3×105 / 4.6×103	10 / 10
2 kbp	1.6×104 / 7.1×103	9 / 10

※使用したコンピテントセルは4.6 × 10⁸ コロニー/μg pUC118 DNAの形質転換効率を持つ。