PrimeSTAR^® Mutagenesis Basal Kit

【方法】

pUC118 DNAのHinc IIサイトに8 kb断片を挿入したプラスミドを鋳型とし、その8 kbを欠失した変異体の取得を試みた。前述のプライマー設計方法に基づいて作製した変異導入プライマーを用い、プラスミド100 pgを鋳型としてPrimeSTAR MaxによるPCR増幅を行った（50 μl反応系）。その2 μlをE. coli JM109コンピテントセル100 μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後、SOC培地1 mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100 μlを選択プレート（LB＋Amp、IPTG、X-gal）上で培養し、青コロニー（変異導入体）と白コロニー（バックグラウンド）をカウントした。さらに、得られた青コロニー（変異導入体）10個よりそれぞれプラスミドを調製し、プラスミドサイズおよびHinc IIサイトの復活を確認した。

【結果】

プラスミド100 pgを鋳型とした場合、変異導入体（青コロニー）158個に対しバックグラウンド（白コロニー）は3個で、98％の確率で変異体が取得できた。変異導入体（青コロニー）10個より取得したプラスミドはすべて8 kbが欠失したサイズのプラスミドであり（図A）、Hinc IIで1箇所切断されて3.2 kbのDNA断片が得られることから（図B）、正しく変異導入（欠失）できていることが確認できた。