変異導入

【方法】

サイズが3.2 kb、7.2 kb、11.7 kbのプラスミド（いずれもpUC118DNAベース）それぞれ100 pgを鋳型に、Xho Iサイトを導入する変異導入プライマーとPrimeSTAR Maxを用いてPCR（50 μl反応系）を行った。その2 μlをE. coli JM109コンピテントセル100 μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後SOC培地1 mlを加えて37℃で1時間振とうした。そのうち100 μlを選択プレート（LB＋Amp）上で培養し、コロニーをカウントした。さらに、得られたコロニー（変異導入体）各10個よりプラスミドを調製してXho I切断を行い、Xho Iサイトの有無ならびに変異導入の成否（正しく変異導入が起こった場合、プラスミドはそれぞれ一箇所で切断される）を判定した。

【結果】

3.2 kb、7.2 kb、11.7 kbの各プラスミドを用いた変異導入（挿入）実験でそれぞれ1,496個、534個、21個のコロニーが得られた。それらより任意に取得したプラスミドの変異導入効率は、それぞれ100％（10/10）、100％（10/10）、80％（8/10）であった（下図）。鋳型のプラスミドサイズが大きくなるに従い、得られる変異体の数は減少するが、変異導入効率は7.2 kbのプラスミドで100％、11.7 kbのプラスミドでも80％と高効率であることが確認できた。



図　Xho I切断後の電気泳動
（上：3.2 kb、中：7.2 kb、下：11.7 kb）