制限酵素Genome DNA Analysis Grade

1. Bacteriaを20 mlのL-brothに植菌し、OD600＝0.6になるまで培養する。
2. 得られたcellをNT Bufferで洗菌し、NT Buffer 1.5 mlに懸濁する。
3. 2．と等量の1％FMC InCert Agaroseを加え、インサートモールドに分注し、固める（アガロースゲルブロック）。
4. 3．を5倍量のEC Solution（1 mg/ml Lysozymeおよび20 μg/ml RNase Aを含む）に浸し、37℃で一晩振とうする。
5. 5倍量のES Solution（1 mg/ml Proteinase Kを含む）に移し、50℃で一晩振とうする。
6. 5倍量のTE Bufferで1時間振とう洗浄後、さらに、5倍量のTE Buffer（1 mM PMSFを含む）に移し、43℃で4時間振とうする（2時間振とう後、さらに1 mM PMSFを加えている）。
7. 5倍量のTE Bufferで数回洗浄し、4℃で保存する。

1. ゲルブロックを10倍量の制限酵素反応Bufferに浸し、37℃、30分間、軽く振とうし、ゲルブロックをバッファライズする。
2. バッファライズされたゲルブロックを2倍量の反応Bufferへ移し、適当量の制限酵素を加え、各酵素の条件で酵素反応を行う（関連情報「制限酵素Genome DNA Analysis Gradeについて」参照）。
3. ゲルブロックを10倍量のES Solutionに移し、50℃、30分～1時間振とうし、制限酵素反応を停止する。
4. 反応停止後、ゲルブロックを10倍量のTE Bufferで洗浄することが望ましい。

各酵素・Genome DNAに適した泳動パターンを得るため、2通りの条件で泳動を行っている。泳動用のゲルにはSeaKem GTG Agarose、BufferはTris-Borate-EDTAを用いている。

電気泳動条件	対象酵素
A）Voltage　　150V 　　Pulse time　30sec 　　Run time　40hrs 　　Buffer temp　14℃ 　　Gel conc　1.2%	Aat II　Bln I　Bst 1107 I　Cla I　Cpo I　 Dra I Fse I　Mun I Nhe I　Not I　Nsp V　PshB I Psp 1406 I Sac II Sfi I Sma I SnaB I Spe I Sse8387 I　Ssp I　Xba I
B）Voltage　120V 　　Pulse time　5sec 　　Run time　40hrs 　　Buffer temp　14℃ 　　Gel conc　1.0%	Aor51H I　Avi II Bgl I　BssH II　Eco52 I 　Mlu I Nae I　Nru I　Pvu I　Sal I　Swa I Xho I

L-broth

Trypton	10 g
Yeast ext.	5 g
NaCl	5 g
Glucose	1 g
H2O(pH7.2)	1 L

EC Solution

6 mM	Tris-HCl (pH7.6)
1 M	NaCl
0.1 M	EDTA (pH7.6)
0.5%	Brij-58
0.2%	Deoxycholate
0.5%	N-Lauroylsarcosine sodium salt

TE Buffer

10 mM	Tris-HCl (pH8.0)
1 mM	EDTA

NT Buffer

1 M	NaCl
10 mM	Tris-HCl (pH7.6)

ES Solution

500 mM	EDTA (pH9.0～9.5)
1%	Lauroylsarcosine

Tris-Borate-EDTA

90 mM	Tris-HCl(pH8.3)
90 mM	Borate
2.5 mM	EDTA