Alkaline Phosphatase (E. coli C75) (BAP)

Polynucleotide Kinaseにより核酸の5’末端を³²Pで標識する際に、核酸の5’末端のリン酸をAlkaline Phosphataseであらかじめ除去しておくと、高い標識効率が得られる。また、異種DNAのクローニングの際にも、ベクター側の5’末端リン酸をAlkaline Phosphataseで処理しておくと、ベクターだけのセルフライゲーションが防げるため、形質転換細胞のバックグラウンドを下げることができる。

マイクロチューブ内で次の反応液を調製し、全量を50 μl にする。

DNA fragments（1～20 pmol)

滅菌精製水

10× Alkaline Phosphatase Buffer*1　5 μl

Bacterial Alkaline Phosphatase（5 U/μl）　1～2 μl*2 または Calf Intestinal Alkaline Phosphatase（30 U/μl）　1～2 μl*2

  ↓
BAPの場合、37～65℃で30分間インキュベートする。
CIAPの場合は37℃で、30分または50℃で、30分間インキュベートする。または37℃で、15分インキュベートした後、50℃で、15分間インキュベートする。^*3
  ↓
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）で抽出する（2回）。^*4
  ↓
クロロホルム/イソアミルアルコール（24：1）で抽出する。
  ↓
2.5 μlの3 M NaClを加える（終濃度150 mM）。
  ↓
エタノール沈殿（2.5倍量の冷エタノールを加え、－20℃で30～60分間保冷後、遠心分離）
  ↓
沈殿を200 μlの70％冷エタノールで洗浄後、乾燥
  ↓
TE Buffer（20 μl以下）に溶解

*1	10× Alkaline Phosphatase Buffer 500 mM Tris-HCl、pH9.0, 10 mM MgCl2
*2	DNAの5’末端1 pmolあたり、BAP、CIAP共に0.01～0.1 Uは必要である。しかし、DNAが制限酵素で切断後、エタノール沈殿で精製されていないときは、完全分解に必要な酵素量はさらに1～2桁多くなる。
*3	一本鎖や5’突出末端の核酸は弱い条件でも充分に脱リン酸化されるが、平滑末端や3’突出末端の場合は高い温度で処理する方がよい。特にBAPによるニック部分の脱リン酸化処理は65℃、30分で行うのが望ましい1)。
*4	BAPの場合は必ず2回おこなう必要がある。CIAPの場合は1回でもかまわない。