TaKaRa Ex Taq^®

Cool Start法を行うことにより、特別な酵素や試薬を使用することなく簡便にPCRの際の非特異的な増幅を抑えることができる。

1. 試薬を全て氷上に置いておく。
2. 試薬分注後の反応チューブは、すぐに氷上に置く。(チューブに加える試薬の順番は問題にならない。調製後30分たってから反応を行っても大丈夫である。)
3. サーマルサイクラーはスタートするだけの状態にしておく。(設定は既存のプログラムでOK。) サンプル数が多い場合は、サンプルブロックをあらかじめ4℃にセットしておく。
4. 反応チューブをサーマルサイクラーにセットし、即スタートする。

Cool Start法とHot Start法とを比較した。さらにA社の推奨するHot Start専用rTaqの方法も比較した。
図1からわかるように、Hot Start法よりもより簡便なCool Start法とTaKaRa Ex Taqを用いることでより高い増幅効率とfidelityを実現できる。

図1 Cool Start法によるPCRの比較

PCR反応条件

【TaKaRa Thermal Cycler480使用】

94℃、1 min. 60℃、1 min.

40 cycles

　↓　60℃、10 min.
3% NuSieve 3：1 agarose
各8 μl泳動
Template：HIV-1 positive control DNAとヒトゲノムDNAのMixture

Lane M	：	φX174-Hinc IIdigest
Lane 1, 4	：	室温調製
Lane 2, 5	：	AmpliWaxによるHot Start法
Lane 3	：	室温調製 + 95℃、9 min pre-incuvation (A社プロトコール推奨)
Lane 6	：	Cool Start法