Cool Start™法
Cool Start法を行うことにより、特別な酵素や試薬を使用することなく簡便にPCRの際の非特異的な増幅を抑えることができる。
■ 操作
- 試薬を全て氷上に置いておく。
- 試薬分注後の反応チューブは、すぐに氷上に置く。(チューブに加える試薬の順番は問題にならない。調製後30分たってから反応を行っても大丈夫である。)
- サーマルサイクラーはスタートするだけの状態にしておく。(設定は既存のプログラムでOK。) サンプル数が多い場合は、サンプルブロックをあらかじめ4℃にセットしておく。
- 反応チューブをサーマルサイクラーにセットし、即スタートする。
Cool Start法とHot Start法の比較
Cool Start法とHot Start法とを比較した。さらにA社の推奨するHot Start専用rTaqの方法も比較した。
図1からわかるように、Hot Start法よりもより簡便なCool Start法とTaKaRa Ex Taqを用いることでより高い増幅効率とfidelityを実現できる。
図1 Cool Start法によるPCRの比較
PCR反応条件
【TaKaRa Thermal Cycler480使用】| 94℃、1 min. 60℃、1 min. |
40 cycles |
3% NuSieve 3：1 agarose
各8 μl泳動
Template：HIV-1 positive control DNAとヒトゲノムDNAのMixture
| Lane M | ： | φX174-Hinc IIdigest |
| Lane 1, 4 | ： | 室温調製 |
| Lane 2, 5 | ： | AmpliWaxによるHot Start法 |
| Lane 3 | ： | 室温調製 + 95℃、9 min pre-incuvation (A社プロトコール推奨) |
| Lane 6 | ： | Cool Start法 |
