DNA Ligation Kit

プラスミドベクターへの外来DNAの挿入（Ver.1)

（1）プラスミドベクター〔0.03 pmol；pUC 18 DNA （2,686 bp）の場合約50 ng〕およびインサートDNA（0.1～0.3 pmol）を含むDNA溶液〔100 mM Tris-HCl（pH7.6）、 5 mM MgCl2が望ましい*〕5～10 μlを用意する。
（2）（1）のDNA溶液の4～8倍量**のA液を添加し、よく混合する。
（3）（1）のDNA溶液と等量のB液（5～10 μl）を添加し、よく混合する。
（4）16℃***で30分間****保温する。
（5）直ちに形質転換を行う場合には、100 μlのコンピテントセルに10～20 μl*****の反応液を加える。

*	TE Buffer（10 mM Tris-HCl（pH8.0）、1 mM EDTA）でもほぼ同様の効率が得られる。
**	DNA溶液を（1）のように調製した場合、またDNA量が0.5 μg以下の場合には、A液は4倍量添加すること。A液はDNA溶液量の8倍まで添加できる。
***	反応温度を上げると（＞26℃）環状DNAが形成されにくくなる。
****	ライゲーションが起こりにくい場合は時間をのばしてもよいが、効率があまり変わらない場合は、DNAを精製し直した方がよい。
*****	Ligation kit溶液は、反応後そのまま形質転換に用いることができるが、溶液をそのままコンピテントセルに加えると、効率が悪くなる場合がある。その場合、反応終了後NaClを終濃度500 mM程度になるように反応液に添加し、形質転換に用いると改善されることがある。また、大量のDNA溶液をコンピテントセルに加える場合、およびエレクトロポレーションにより形質転換を行う場合はエタノール沈殿によりDNAを回収してから行うこと。