O-157 (ベロ毒素1型、2型遺伝子) PCR Typing Set

食品培養液からの腸管出血性大腸菌のDNA抽出には、下記のアルカリ熱抽出法を推奨する。

【アルカリ熱抽出法】

食品培養液100 μlを1.5 mlまたは2.0 ml容量のねじ口チューブに採取する。
｜	← 10,000×g、10分間遠心して上清を除く。
｜	← 沈渣に100 μlの50 mM NaOH Solution（滅菌済み）85 μlを添加し、100℃で10分間加熱処理する。
｜	← 1M Tris-HCl (pH7.0)（滅菌済み）15 μlを加えて中和する。
｜	←2,000～10,000×gで10分間遠心する。
上清を検体とする

＊食品培養液は、それぞれ適切な標準プロトコールに従って食品サンプルから調製したものを用いる。

1. PCRチューブ に以下の反応液を氷上にて調製する。
   ＜VT1の検出＞
   

   反応液組成	液量	終濃度
   10×Ex Taq Buffer	5 μl	［1×］
   dNTP Mixture（各2.5 mM）	4 μl	各200 μM
   EVT-1 Primer	0.5 μl	0.19 μM
   EVT-2 Primer	0.5 μl	0.19 μM
   菌体熱抽出サンプル	5 μl
   TaKaRa Ex Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   滅菌精製水	34.75 μl
   Total	50 μl

   
   ＜VT2の検出＞
   

   反応液組成	液量	終濃度
   10×Ex Taq Buffer	5 μl	［1×］
   dNTP Mixture（各2.5 mM）	4 μl	各200 μM
   EVS-1 Primer	0.5 μl	0.19 μM
   EVS-2 Primer	0.5 μl	0.19 μM
   菌体熱抽出サンプル	5 μl
   TaKaRa Ex Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   滅菌精製水	34.75 μl
   Total	50 μl

   Negative Controlとしてサンプルのかわりに滅菌精製水を添加したものを用意する。
   （1回のPCR反応に1本でよい）



2. PCRチューブに以下のコントロール反応液を氷上にて調製する。（1回のPCRにつき1本でよい）
   ＜VT1用コントロール＞
   

   反応液組成	液量	終濃度
   10×Ex Taq Buffer	5 μl	［1 × ］
   dNTP Mixture（各2.5 mM）	4 μl	各200 μM
   EVT-1 Primer	0.5 μl	0.19 μM
   EVT-2 Primer	0.5 μl	0.19 μM
   Control template EC2	0.5 μl	50 pg/50 μl
   TaKaRa Ex Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   滅菌精製水	39.25 μl
   Total	50 μl

   
   ＜VT2用コントロール＞
   

   反応液組成	液量	終濃度
   10×Ex Taq Buffer	5 μl	［1×］
   dNTP Mixture（各2.5 mM）	4 μl	各200 μM
   EVS-1 Primer	0.5 μl	0.19 μM
   EVS-2 Primer	0.5 μl	0.19 μM
   Control template EC3	0.5 μl	50 pg/50 μl
   TaKaRa Ex Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   滅菌精製水	39.25 μl
   Total	50 μl



3. PCRチューブをTaKaRa PCR Thermal Cyclerにセットし、PCR反応を開始する。

   PCR条件

   94℃	1 min	35 cycles
   55℃	1 min
   72℃	1 min
   72℃	10 min	1 cycle

   反応は約2.5時間で終了する。反応後のサンプルは4℃、または－20℃で保存可能である。



4. 反応終了後、反応液10 μlをアガロースゲル電気泳動する。
   （アガロースゲルは3％ Agaroseが望ましい）

サンプル中にベロ毒素1型遺伝子が存在すれば、349 bpの増幅産物（バンド）が検出され、2型遺伝子および2型の変異遺伝子が存在すれば、 404 bpの増幅産物が検出される。 また、Positive controlでは、686 bpのバンドが検出される。

電気泳動結果	判　　定
1）Primer EVT-1/2を使用した場合、サンプルのレーンに349 bpのバンドが認められる。	ベロ毒素1型遺伝子（VT1）陽性株である。
2）Primer EVS-1/2を使用した場合、サンプルのレーンに404 bpのバンドが認められる。	ベロ毒素2型遺伝子（VT2）または2型の変異遺伝子（VT2vha、VT2vhb、VT2vp1）陽性株である。
3）サンプルのレーンに349 bpまたは404 bpのバンドが認められず、かつPositive Controlのレーンにバンド（686 bp）が検出された。	ベロ毒素遺伝子陰性株である。
4）サンプル、Positive Controlいずれのレーンにもバンドが検出されない。	陽性、陰性を確定できない。何らかの原因でPCR反応が正常に行われていない可能性が高いので、再度PCRを行う。
5）Negative Controlのレーンに349 bpもしくは404 bpのバンドが認められた。	コンタミネーションを起こしていると考えられる。 反応液調製場所、および使用した機器、試薬等を除染したうえで再度検出を行う。