Standard Protocol
（3'-Full RACE Core Set）
■ 操作手順
- 逆転写反応
＊ Experimental sampleは発現量の少ないRNAの場合、9.5 μlまで反応系に持ちこむことができる。最終濃度 10×RNA PCR Buffer 2 μl 1× MgCl2（25 mM） 4 μl 5 mM dNTP Mixture（10 mM） 2 μl 1 mM AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μl） 1 μl 0.25 U/μl RNase Inhibitor（40 U/μl） 0.5 μl 1 U/μl Oligo dT-3sites Adaptor Primer（2.5 μM） 1 μl 0.125 μM Positive Control RNA or Experimental sample* 1 μl （2×105 copies or ≦ 1 μg total RNA ） RNase Free dH2O 8.5 μl Total 20 μl
- PCR用チューブに反応液を混和後、ミネラルオイル50～100 μlを重層する。
- 調製済みのチューブをサーマルサイクラーにセットし、右のプログラムで反応を行う。
30℃ 10 min 1 cycle 50℃ 15～30 min 95℃ 5 min 5℃ 5 min
- PCR反応
PCR反応にはTaKaRa Taq（製品コード R001A）、TaKaRa Ex Taq（製品コード RR001A）、またはPremix Taq（EX Taq Version）、Premix Taq（ EX Taq Version）（製品コード RR003A）、One Shot LA PCR Mix（製品コード RR004）、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1（製品コード RR013A/B）を使用する。通常、TaKaRa Taqを用いた反応で充分だが、目的とするターゲットの鎖長が長い場合や、高い増幅効率を望む場合は、TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1あるいはOne Shot LA PCR Mixを使用する。
- 下記に示す反応液を調製する。
TaKaRa Taqの場合 注：TaKaRa Taqを用いる場合はPCR反応の際にdNTP Mixtureを新たに加える必要はない。
最終濃度 TaKaRa Taq添付 10×PCR Buffer 8 μl 0.8× MgCl2（25 mM） 6 μl 2.5 mM TaKaRa Taq（5 U/μl） 0.5 μl 0.025 U/μl 上流PCRプライマー（20 μM） （Control RNAの場合、Control F-1-3sites Adaptor Primer） 1 μl 0.2 μM 3sites Adaptor Primer（20μM） 1 μl 0.2 μM A. の逆転写反応液 20 μl 滅菌精製水 63.5 μl Total 100 μl
＜TaKaRa Ex Taq or TaKaRa LA PCR Kit Ver.2.1の場合＞
* 10×Ex Taq Buffer、10×LA PCR Buffer II（Mg2＋plus）はそれぞれTaKaRa Ex Taq(製品コード RR001A/ B/C）、TaKaRa LA PCR Kit Ver.2.1（製品コード RR013A/B）に添付。最終濃度 10×Ex Taq Buffer（Mg2＋plus）or10×LA PCR Buffer II（Mg2＋plus）* 10 μl 1× dNTP Mixture（各2.5 mM）** 16 μl 0.6 mM TaKaRa Ex Taq or TaKaRa LA Taq（各5 U/μl） 0.5 μl 0.025 U/μl 上流PCRプライマー（20 μM） （Control RNAの場合、Control F-1-3sites Adaptor Primer） 1 μl 0.2 μM 3sites Adaptor Primer（20 μM） 1 μl 0.2 μM 前頁A. の逆転写反応液 20 μl 滅菌精製水 51.5 μl Total 100 μl
** dNTP Mixture（各2.5 mM）はTaKaRa Ex Taq（製品コード RR001A/B/C）に添付している。TaKaRa LA Taq（製品コード RR002A）を使用する場合は、dNTP Mixture（各2.5 mM）（製品コード 4030）を別途ご購入ください。
Premix Taq（TaKaRa Taq VersionまたはEx Taq Version）、またはOne Shot LA PCR Mixの場合＞最終濃度 One Shot LA PCR Mix（0.2 ml PCR用チューブ分注済） 25 μl 上流PCRプライマー（20 μM） 1 μl 0.2 μM 3sites Adaptor Primer（20μM）
（Positive control RNAの場合、Control F-1-3sites Adaptor Primer）1 μl 0.2 μM 前頁A. の逆転写反応液 10 μl 滅菌精製水 13 μl Total 50 μl - マイクロ遠心機で約10秒間遠心した後、ミネラルオイル50～100 μlを重層する。
（TaKaRa Thermal Cycler MP、PERSONALの場合は不要） - 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムで増幅させる。
PCR条件
94℃ 30 sec 30 cycles 55℃ 30 sec 72℃ 2 min - 反応終了後、反応液の一部（5～10 μl）をアガロース電気泳動を行い、反応産物を確認する。
PCR増幅産物は、解析するまで凍結保存しておく。
Positive Control RNAを用いた場合の増幅断片は約1.1 kbpになる。
- Annealing温度
コントロールRNAの場合、55℃で行っているが、実際のサンプルは条件が変わるので、37～65℃の範囲で至適温度を調べる必要がある。 - Extension time
Extension time は、ターゲットのシークエンスの長さに影響される。通常、TaKaRa Taq、TaKaRa Ex Taqは、70～80℃で1分間に2,000～4,000 basesの割合でextensionを行う。 - Cycle数
cDNA量が少ない場合は、40～50 cycles行う必要がある。
- 下記に示す反応液を調製する。
