BcaBEST^® RNA PCR Kit Ver. 1.1

A．逆転写反応

1. 下記に示す反応液を調製する。

   試薬	使用量	最終濃度
   MgSO4(25 mM)	2 μl	5 mM
   2×Bca 1st Buffer	5 μl	1×
   RNase Free dH2O	0.75 μl
   dNTP Mixture（各10 mM）	0.5 μl	0.5 mM
   RNase Inhibitor	0.25 μl	1 U/μl
   BcaBEST polymerase(22 U/μl)	0.5 μl	1.1 U/μl
   Random 9 mers 　　　　or Oligo dT Primer 　　　　or 特異的下流プライマー （R-1 Primer）	0.5 μl	2.5 μM 　or 0.125 μM 　or 1 μM
   Positive Control RNA 　　　　or Experimental Sample	0.5 μl	［1×105 copies］ 　or ［≦ 500 ng total RNA］
   Total	10 μl/sample

   * Experimental Sampleは発現量の少ないRNAの場合、Volumeを1.25 μlまで持ち込むことが可能。
2. A. -1の反応液を混合後、ミネラルオイルを重層する。
   （TaKaRa Thermal Cycler Dice、GP、SP、MP、PERSONALの場合不要）
   反応に用いるプライマーは、Random 9 mers、Oligo dT Primer、特異的下流プライマー（Positive Control RNAの場合はControl R-1 Primer）のいずれかを選ぶ。
   調製済みのチューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで反応を行う。
   

B．PCR反応

1. 下記に示す反応液を調製する。

   試薬	使用量	最終濃度
   MgSO4（25 mM）	3 μl	2.5 mM
   5 × Bca 2nd Buffer	8 μl	1×
   Bca-Optimized Taq	0.25 μl	2.5 U/50 μl
   上流センスプライマー（20 μM） （Control RNAの場合F-1 Primer）	0.5 μl	0.2 μM
   下流アンチセンスプライマー（20 μM） （Control RNAの場合R-1 Primer）	0.5 μl	0.2 μM
   滅菌精製水	27.75 μl
   Total	40 μl/sample

   1'. 上記反応条件で増幅産物が得られないサンプルの場合(変法)
   　 以下の反応組成をお試しください。改善される場合があります。

   試薬	使用量	最終濃度
   MgSO4（25 mM）	3 μl	2.5 mM
   2×Bca 1st Buffer	20 μl	1×
   Bca-Optimized Taq	0.25 μl	2.5 U/50 μl
   上流センスプライマー（20 μM）	0.5 μl	0.2 μM
   下流アンチセンスプライマー（20 μM）	0.5 μl	0.2 μM
   滅菌精製水	15.75 μl
   Total	40 μl/sample

2. 1.の反応液 40 μlをA-2. で逆転写反応を終了したチューブに添加する。
3. マイクロ遠心機で約10秒間、遠心する。
4. 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムで増幅させる。
   

   一般的な反応条件

   94℃	30 sec	25～30 cycles
   37～65℃	30 sec
   72℃	1～10 min
   72℃	5 min

   Positive Control RNAの場合

   94℃	30 sec	28 cycles
   60℃	30 sec
   72℃	1 min

5. 反応終了後、反応液の一部（5～10 μl）でアガロースゲル電気泳動を行い、反応産物を確認する。
   PCR増幅産物は解析するまで凍結保存する。