菌体熱抽出サンプルからの検出例
（O-157（ベロ毒素遺伝子）One Shot PCR Screening Kit Ver.2）
A.菌体熱抽出サンプルの調製
- 増菌培養液4 μlを1.5 ml tubeに、または0.2 ml PCR tubeにとる。
- 滅菌水を1.5 ml tubeの場合は196 μl、0.2 ml tubeの場合は98 μl加えて混合する。
- 95℃で5分間熱処理する（0.2 ml PCR tubeの場合はサーマルサイクラーを利用すると簡便に行うことができる）。
- 遠心分離（12,000 rpm、4℃、10分）し、上清を回収する。これを熱抽出サンプルとする。
＊増菌培養液は、それぞれ適当な標準プロトコールにしたがって食品サンプルから調製したものを用いる。また、熱抽出サンプルは－20℃で保存可能である。
B.PCR反応例
- 2×One Shot PCR solution tubeに調製した熱抽出サンプルを25 μl添加する。（エリア3で実施）
Negative controlとして滅菌水を25 μl加えたものを1本用意する。（エリア1で実施） - 各チューブのキャップをしっかりと閉め、サーマルサイクラーにセットしてPCR反応を開始する。
PCR条件
94℃ 1 分 35 cycles 55℃ 1 分 72℃ 1 分 72℃ 10 分 1 cycle
※反応は約2.5時間で終了する。反応後のサンプルは4℃、または－20℃で保存可能である。
※TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceを使用する場合は、以下の条件でも上記条件とほぼ同等の反応性が得られる。
98℃ 10秒 35 cycles 55℃ 10秒 72℃ 10秒 72℃ 30秒
- 反応終了後、反応液10 μlをアガロース電気泳動する。
（アガロースゲルは3％ PrimeGel Agarose PCR-Sieveが望ましい）
C.判定(下図参照)
サンプル中にベロ毒素遺伝子が存在すれば、171 bpの増幅産物（バンド）が検出される。 また、Positive control（control template）由来の685 bpのバンドが検出される。
| 電気泳動結果 | 判 定 |
| (1)171 bpのバンドが検出された。 | Positive controlのバンドの有無にかかわらず、ベロ毒素遺伝子陽性である。（ベロ毒素遺伝子が多量に存在する場合、Positive controlのバンドは消失する） |
| (2)171 bpのバンドが検出されず、かつPositive controlのバンド(685 bp)が検出された。 | ベロ毒素遺伝子は検出限界以下である。 |
| (3)何もバンドが検出されない。 | 陽性、陰性を確定できない。何らかの原因でPCR反応が正常に行われていない可能性が高いので、再度PCRを行う。 |
| (4)Negative controlのレーンに171 bpのバンドが検出された。 | コンタミネーションを起こしていると考えられる。反応液調製場所および使用した機器を除染したうえで再度検出を行う。 |
D.実験例
VT1およびVT2遺伝子陽性株培養液からプロトコールにしたがって調製したサンプルをtemplateとして本キットを用いてPCRを行った。
 |
3％ Agarose gelで電気泳動。エチジウムブロマイドで先染めしたものである。 |
|||||||||||||||||
E．操作上の注意
万一、プライマーがヌクレアーゼの混入により分解されると、正確な検出が出来ない。実験者の汗や唾液からもヌクレアーゼが混入する可能性があるので、操作は
細心の注意を払う。
反応液の調製から検体サンプルの添加まで、次の4つのエリアを設定し、物理的に隔離することを推奨する。各エリアにおいては、増幅産物の入ったチューブの開閉は避ける。
○エリア1：PCR反応液の調製、分注を行う。
○エリア2：検体の調製（DNA抽出等）を行う。
○エリア3：PCR反応液へ鋳型DNAの添加を行う。
○エリア4：電気泳動等でPCR増幅産物の解析を行う。
反応液の調製から検体サンプルの添加まで、次の4つのエリアを設定し、物理的に隔離することを推奨する。各エリアにおいては、増幅産物の入ったチューブの開閉は避ける。
○エリア1：PCR反応液の調製、分注を行う。
○エリア2：検体の調製（DNA抽出等）を行う。
○エリア3：PCR反応液へ鋳型DNAの添加を行う。
○エリア4：電気泳動等でPCR増幅産物の解析を行う。
