Westase™を用いた酵母からのゲノムDNA抽出精製プロトコール
【試薬】
| ・SEC | 0.4 M Sodium tartrate | |
| 100 mM EDTA | ||
| 10 mM Citrate phosphate, pH6.0 | ||
| ・EDTA溶液 | 10 mM Tris-HCl, pH7.5 | |
| 100 mM EDTA | ||
| ・TE-1 | 50 mM Tris-HCl, pH7.5 | |
| 20 mM EDTA | ||
| ・TE-2 | 10 mM Tris-HCl, pH8.0 | |
| 1 mM EDTA | ||
| ・Westase溶液 | 10 mg/ml SEC | |
| ・Proteinase K溶液 | 10 mg/ml TE-1 | |
| ・RNase A溶液 | 1 mg/ml TE-2 | |
| ・10％ SDS | ||
【手順】
- 酵母をYPD培地で対数増殖期後期まで培養し、集菌、洗浄する。
- 菌体（培養液200または400 ml相当）を5 mlのSECに懸濁した後、5 mlのWestase溶液を加え、ゆっくり振盪しながら37℃で15～40分間反応する。
- 2,500 rpmで10分間遠心して集菌する。
- 5 mlのSECに穏やかに懸濁し、2,500 rpmで10分間遠心して集菌する。
- 4 mlのTE-1に懸濁し、0.5 mlのProteinase K溶液、0.5 mlの10％ SDSを加えて37℃で40分間反応する。
- 5 mlのフェノール/クロロホルム（1：1）を加えて室温で40分間ゆっくりと混合する。
- 室温、3,000 rpmで10分間遠心する。
- 上層（水層）を新しいチューブに移す。
- 100％ 冷エタノールを2倍量加えて穏やかに混合し、生成した糸状のDNAをガラス棒で巻き取る。巻き取れない場合は、遠心して沈殿として回収し、70％ 冷エタノールで洗浄する。
- DNAを2 mlのEDTA溶液に完全に溶解した後、40 μlのRNase A溶液を加えて37℃で2時間反応する。
- フェノール/クロロホルム抽出を2回行った後、クロロホルム抽出を1回行う。
- 9.の操作を行う。
- 0.5～1.0 mlのTE-2に溶解する。
